Gentechnisch veränderte Proteine. Protein-Engineering. Die Rolle von TNF bei der Pathogenese rheumatoider Arthritis und anderer Autoimmunerkrankungen

PROTEIN ENGINEERING, insbesondere Molekularbiologie und Bioingenieurwesen, das darauf abzielt, die Struktur natürlicher Proteine direkt zu verändern und neue Proteine aus den von den Behörden zugewiesenen zu extrahieren. Das Protein-Engineering begann Anfang der 1980er Jahre, als gentechnische Methoden entwickelt wurden, die es ermöglichten, verschiedene natürliche Proteine aus Bakterien oder Hefen zu isolieren sowie die Struktur von Genen und damit die Aminosäuresequenz (Primärstruktur) zu identifizieren. von Proteinen, die kodiert werden. Basierend auf den Prinzipien der Organisation von Proteinmolekülen, der Wechselwirkung zwischen Struktur und Funktion von Proteinen, schafft Protein Engineering eine wissenschaftlich fundierte Technologie zur direkten Veränderung ihrer Struktur. Mit Hilfe zusätzlicher Proteintechnik ist es möglich, die Thermostabilität von Proteinen, ihre Widerstandsfähigkeit gegen denaturierende Infusionen, organische Wirkstoffe und eine Veränderung der Ligandenbindungskraft zu erhöhen. Protein-Engineering ermöglicht es, Aminosäuren zu ersetzen, die Funktion von Enzymen und ihre Spezifität zu verbessern, die optimalen pH-Werte zu ändern, bei denen das Enzym arbeitet, unnötige Nebenaktivitäten auszuschalten, diese Moleküle zu reduzieren und enzymatische Reaktionen zu reduzieren und die Wirksamkeit von Proteinarzneimitteln zu fördern . Beispielsweise erhöhte der Ersatz nur eines Überschusses an Threonin durch einen Überschuss an Alanin oder Prolin die Aktivität des Enzyms TyrosyltRNA-Synthetase um das 50-fache, und durch den Ersatz von 8 Aminosäureüberschüssen, der sogenannten Thermolysin-ähnlichen Protease durch Bacillus stearothermophilus, nahm die Bedeutung zu des Sparens ist entstanden2. Protein-Engineering kann auch durchgeführt werden, indem die Leistung von Proteinen durch zusätzliche chemische Modifikationen direkt verändert wird, beispielsweise durch die Einführung photoaktivierter Verbindungen, die die Leistung von Molekülen in Kontakt mit ihnen verändern. Es ist notwendig, die Markierungen zu verbinden, die es ermöglichen, die Bewegungspfade festzulegen das Protein im Protein oder leiten Sie es an verschiedene Komponenten-Clients und dergleichen weiter. Es ist wichtig, dass solche Roboter an gentechnisch hergestellten rekombinanten Proteinen arbeiten.

Es gibt zwei Arten des Protein-Engineerings: rationales Design und direkte molekulare Evolution von Proteinen. Zunächst einmal schätzen wir die Verfügbarkeit von Informationen über die strukturellen und funktionellen Informationen in Proteinen, die mithilfe physikalisch-chemischer und biologischer Methoden sowie computergestützter molekularer Modellierung gewonnen wurden, sodass wir in der Lage sind, etwaige Änderungen an der Primärstruktur vorzunehmen das gewünschte Ergebnis erzielen. Um die Thermostabilität eines Proteins zu erhöhen, ist es daher notwendig, seine räumliche Struktur zu bestimmen, „schwache“ Abschnitte zu identifizieren (z. B. Aminosäuren, die nicht ausreichend an ihre Eigenschaften gebunden sind) und die besten Optionen für sie Min auf anderen Amino auszuwählen Säuren zur zusätzlichen molekularen Modellierung und Optimierung der Energieparameter des Moleküls; Dann mutieren Sie das Gen und entfernen und überwachen Sie dann das mutierte Protein. Wenn dieses Protein die angegebenen Parameter nicht erfüllt, führen Sie eine neue Analyse durch und wiederholen Sie den Beschreibungszyklus. Dieser Ansatz wird am häufigsten bei der Konstruktion kundenspezifischer Proteine (De-novo-Proteine) unter bestimmten Autoritäten verwendet, wenn der Input eine neue Aminosäuresequenz enthält, die hauptsächlich oder vollständig vom Menschen bestimmt wird, und der Output ein Proteinmolekül mit den erforderlichen Eigenschaften ist . Vorerst ist es auf diese Weise jedoch möglich, kleine Proteine mit einer ungünstigen räumlichen Struktur de novo zu isolieren und in sie einfache funktionelle Aktivitäten einzuführen, beispielsweise Metallteile oder kurze Peptidfragmente, die von Biologen persönliche Funktionen übernehmen können.

Bei der Steuerung der molekularen Evolution von Proteinen wird mit Hilfe gentechnischer Methoden ein großer Satz verschiedener mutierter Gene des gesamten Proteins isoliert, die dann auf besondere Weise exprimiert und auf der Oberfläche von Phagen montiert werden („fa govy display“) „) oder in Bakterienzellen, um eine mögliche Selektion der Mutanten mit den besten Eigenschaften zu erreichen. Auf diese Weise werden beispielsweise die Gene für das benötigte Protein oder seine Teile vom Phagengenom erzeugt – bis sich das Gen, das für das Protein kodiert, auf der Oberfläche des Phagenpartikels ablagert. In diesem Fall trägt der einzelne Phage sein eigenes mutiertes Protein, das die Macht hat, die Wahl zu bekämpfen. Mutierte Gene werden identifiziert, indem eine Reihe von Genen ähnlicher natürlicher Proteine verschiedener Organismen „vermischt“ werden, üblicherweise unter Verwendung der zusätzlichen Methode der Polymerase-Lanziug-Reaktion, sodass die Haut, die mutierte Proteine enthält, ein Fragment und viele Proteine des „Vaters“ enthalten kann. Tatsächlich erfolgt bei diesem Ansatz die Evolution von Proteinen auf natürliche Weise oder in einem deutlich beschleunigten Tempo. Die Hauptaufgabe eines Proteiningenieurs liegt in diesem Zusammenhang in der Entwicklung eines effektiven Selektionssystems, das die Auswahl der besten mutierten Proteinvarianten mit den erforderlichen Parametern ermöglicht. Bei einer wichtigeren Aufgabe – der Erhöhung der Thermostabilität des Proteins – kann die Selektion beispielsweise durch Erhöhung der Anwesenheit von Zellen durchgeführt werden, um mutierte Gene zu rächen. und das mutierte Protein hat eine größere thermische Stabilität).

Die beiden Namen der Richtungen des Protein-Engineerings sind ähnlich und ergänzen sich. Die Verfolgung der Ergebnisse, die mit anderen Methoden der molekularen Evolution mutierter Proteinvarianten erzielt wurden, ermöglicht es uns daher, die strukturelle und funktionelle Organisation von Proteinmolekülen besser zu verstehen und Erkenntnisse für gezielte Reaktionen zu gewinnen, die sich ideal für das Design neuer Proteine eignen. Die Weiterentwicklung des Protein-Engineerings ermöglicht die Entwicklung vieler praktischer Anwendungen zur Verbesserung natürlicher und zur Schaffung neuer Proteine für die Bedürfnisse der Medizin, Landwirtschaft und Biotechnologie. Es ist möglich, dass Proteine gebildet werden, die in der lebenden Natur unbekannte Funktionen erfüllen.

Lit.: Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Protein-Engineering 20 Jahre später // Nature Reviews. Molekulare Zellbiologie. 2002. Bd. 3. Nr. 12; Patruschew L. I. Stück genetische Systeme. M., 2004. T. 1: Gen- und Protein-Engineering.

Gentechnische Methoden, einschließlich des Klonens einzelner Gene und ihrer Teile sowie der DNA-Sequenzierung, haben es ermöglicht, die Methodik der Mutagenese erheblich zu verbessern und die Hauptmängel klassischer Methoden zur Induktion von Mutationen in Genomen zu beseitigen. Die klassische genetische Analyse überträgt den Einstrom eines mutagenen Faktors in vivo auf das gesamte Genom, was zu zufälligen, oft mehrfachen Mutationen führt, was die Identifizierung von Mutanten erschwert. Die Identifizierung mutierter Individuen erfolgt aufgrund von Veränderungen der phänotypischen Merkmale, und die Art der Mutation kann nach der DNA-Sequenzierung bestimmt werden. Die heutige Lokalisierungsmutagenese führt im Wesentlichen die gleichen Schritte aus: Klonen des zu klonenden Gens oder Segments, Bestimmung seiner Struktur während der Sequenzierung und anschließende Durchführung der erforderlichen Änderungen in vitro. Die Vererbung der verursachten Mutation erfolgt nach der Einführung des mutierten Gens in den Zielorganismus.

Die einfachste Version der lokalisierten Mutagenese besteht darin, ein geklontes DNA-Fragment mit einem der mutagenen Faktoren zu beproben. Das Ergebnis eines solchen Zustroms wird auch schnelle Veränderungen in der Struktur des Fragments sein. Die zuverlässigsten und am häufigsten verwendeten Methoden der lokalisierten Mutagenese funktionieren ohne die Anwesenheit mutagener Faktoren. Unter den Mutationsarten sind Deletionen, Insertionen und Nukleotidsubstitutionen wichtig.

zum Boden. Diese Arten von Mutationen bei der lokalisierten Mutagenese sind auf die Unterstützung von Endonukleasen angewiesen. Sowohl Restriktionsendonukleasen als auch unspezifische Endonukleasen wirken als Vicoristen. Die einfachste Art von Restriktionsenzymen erfolgt bei der Spaltung des Genoms mit Hilfe eines zusätzlichen Restriktionsenzyms, das durch die Bildung klebriger Enden eine Reihe von Störungen verursacht. Die entfernten Fragmente werden hinter zusätzlicher DNA-Ligase wieder am Ring geschlossen, was zur Bildung von Molekülen führen kann, die keinen der DNA-Abschnitte ersetzen. Bei diesem Ansatz werden lange Deletionen gebildet und deren Mutationen meist in frühen Experimenten durchgeführt, um die Funktionen großer Abschnitte geklonter DNA zu bestimmen.

Auf diese Weise können kleine Löschungen erreicht werden. Das Klonierungsfragment wird an der Vektorspeicherstelle an der spezifischen Stelle unter Verwendung eines Restriktionsenzyms gespalten (Abb. 21.1). Das aufgelöste lineare Molekül wird durch Exonuklease III abgetrennt, die eine Lanze im DNA-Lager hydrolysiert,

beginnend am 3'-Ende. Das Ergebnis ist eine Reihe von Molekülen mit einspurigen 5'-Schwänzen unterschiedlicher Länge. Diese Schwänze werden durch die S1-Nuklease, die spezifisch für einzelsträngige DNA ist, hydrolysiert und es entstehen DNA-Deletionen. Es ist auch möglich, die Exonuklease Bal 31 zu aktivieren, die den Abbau beider DNA-Moleküle ausgehend von den Enden linearer DNA-Moleküle katalysiert. Der Verlauf nukleotischer Reaktionen wird durch Variation der Inkubationsstunde, Temperatur und Konzentration des Enzyms reguliert, das die Deletion verschiedener Proteine induziert. Beim Entfernen von Deletionsvarianten linearer DNA werden vor der Cyclisierung häufig Linker hinzugefügt, damit Restriktionsstellen im Bereich der Deletion vorhanden sind. Entdecken Sie weitere Änderungen an den Beschreibungen dieser Methoden.

Einfügung (Einfügungen). Um Einfügungen zu entfernen, wird geklonte DNA mit einem Restriktionsenzym oder einer unspezifischen Endonuklease gespalten und anschließend werden Fragmente hinzugefügt, die in Gegenwart des Segments entstehen, das in die DNA eingefügt werden soll. Am häufigsten werden solche Segmente durch die chemische Methode Polylinkerie synthetisiert (Kapitel 20).

Insertionen wie Deletionen können die Integrität eines Gens oder die Struktur seiner regulatorischen Regionen zerstören, wodurch die Synthese eines defekten Proteins (bei langen Deletionen ist der Leseraster meist inaktiv) oder verhindert wird Ändern Sie den Prozess der Gentranskription, also klicken Sie. Auf diese Weise werden häufig regulatorische Mutanten isoliert und Vektoren für die Expression konstruiert (Kapitel 20).

Punktmutationen . Bei diesen Mutationen handelt es sich um den Ersatz von Nukleotiden. Um sie zu entfernen, können verschiedene Ansätze verwendet werden: Cytosin-Minenentfernung, Einschluss von Nukleotidanaloga, falscher Einschluss von Nukleotiden während der Lückenreparatur usw.

Die erste Methode basiert auf der Tatsache, dass überschüssiges Cytosin in einzelsträngiger DNA mithilfe von Bisulfit und Ionenverarbeitung von Uracil desaminiert werden kann. Einspurige DNA-Fragmente entstehen in der Nähe von Restriktionsstellen, beispielsweise während der Wirkung von Exonuklease III. Vergessen Sie nach der Behandlung der einseitigen Brüche mit Bisulfit den Einsatz von DNA-Polymerase und die Ligation der Enden. An Stellen, an denen Cytidylat durch desaminiertes Uridylat ersetzt wird, wird Adenylat komplementär, und während der Replikation eines solchen Moleküls wird das GC-Paar durch das AT-Paar ersetzt.

Ein anderer Ansatz zur Induktion von Substitutionen besteht darin, eine geklonte DNA-Probe unter Verwendung eines Restriktionsenzyms in Gegenwart von Ethidiumbromid zu verwenden, das zwischen den Basenpaarbereichen auftritt und die Struktur des Duplex zerstört. Dadurch entsteht einzelsträngige DNA. Erstellen Sie an der Stelle eines Einzelstrangrisses eine kleine Lichtung und vergessen Sie diese dann in Gegenwart von DNA-Polymerase, dATP, dGTP, dCTP und N-4-Hydroxycytosintriphosphat anstelle von dTTP. Hydroxycytosintriphosphat ersetzt Thymidylat, paart sich jedoch während der DNA-Replikation besser mit Adenylat und Guanylat. Durch den Einbau von Guanylat nach der zusätzlichen Replikationsrunde an dieser Stelle kommt es zur AT→GC-Substitution (Abb. 21.2). Die Fragmente bei dieser Methode des Nukleotidaustauschs liegen in der Mitte

Durch die Restriktionsstelle ist es möglich, Vektoren leicht von der Ausgangssequenz und mutierten Vektoren zu trennen. Dazu reicht es aus, sie mit einem Restriktionsenzym zu verdauen, was im Experiment getestet wird: Mutierte Moleküle können nicht gespalten werden.

Eine ähnliche Methode basiert auf Vicoristan mit nur drei von vier möglichen Nukleotiden, wenn ein Einzelstrangbruch mit DNA-Polymerase gefüllt wird. Am häufigsten bindet das Enzym dort Moleküle und es entsteht ein komplementäres Nukleotid. Allerdings wird die DNA-Polymerase so modifiziert, dass sie eines der drei vorhandenen Nukleotide enthält. Dies führt zur Bildung von Ringmolekülen, die ungepaarte, inkomplementäre stickstoffhaltige Basen enthalten. Wenn solche Vektoren in Bakterienzellen eingeführt werden, werden bei einigen Molekülen solche Schäden repariert. Dadurch kehrt die Hälfte der Moleküle nach der Replikation zur Ausgangssequenz zurück und in der anderen Hälfte wird die Mutation fixiert. Mit der beschriebenen Methode können mutierte Moleküle isoliert werden.

Ortsspezifische Mutagenese. Charakterisierte Methoden der lokalisierten Mutagenese zeichnen sich dadurch aus, dass die Orte, an denen Mutationen auftreten, zufällig ausgewählt werden. Gleichzeitig ermöglicht die Technik der ortsspezifischen Mutagenese, Mutationen in einen einzelnen Abschnitt eines Gens einzuführen. Es funktioniert mit einer Vielzahl synthetischer (durch chemische Synthese reduzierter) Oligonukleotide mit einer vorgegebenen Sequenz. Die Methode ist einfach, da keine manuellen Restriktionsstellen erforderlich sind. Die Methode basiert auf der Bildung von Heteroduplexen zwischen einem synthetischen Oligonukleotid zur Verhinderung von Mutationen und komplementärer einzelsträngiger DNA im Vektorspeicher.

Finden Sie einen solchen Weg. Synthetisieren Sie ein kleines Oligonukleotid (8–20 Monomere), das zu diesem Teil des Gens komplementär ist, um die Mutation zu beseitigen. Die Lagerung des Oligonukleotids im zentralen Abschnitt ermöglicht eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen. Klonen des verfolgten Gens oder seines Fragments aus dem Stammvektor auf Basis des M13-Phagen, um zirkuläre einspurige rekombinante DNA zu enthalten. Rekombinante Vektoren mit Oligonukleotiden werden gemischt und verwendet. Es kommt zu einer Hybridisierung des Oligonukleotids mit der komplementären Region und nichtkomplementäre Nukleotide werden aus ungepaarten eliminiert. Das Oligonukleotid spielt eine Rolle als Primer für die Polymerasereaktion unter Beteiligung der DNA-Polymerase in vitro. Die Ringe blinken vor Gasen. Das entfernte Ringmolekül wird in E. coli-Zellen eingeführt, wodurch eine teilweise Wiederherstellung der Mutantenreplikation erreicht wird. Die Mutationshäufigkeit variiert zwischen 1 und 50 %. Die Auswahl von Zellen zum Ersetzen mutierter DNA-Moleküle kann auf verschiedene Weise erfolgen. Zu den Vorteilen gehört die Methode der Verwendung eines radioaktiv markierten Oligonukleotids, das zur Mutagenese stagniert. Dieses Nukleotid dient als Sonde. Das Prinzip einer solchen Sonde basiert auf der Tatsache, dass sie teilweise komplementär zu mutierter DNA und teilweise komplementär zu Wildtyp-DNA ist. Es ist möglich, solche Hybridisierungen (zuerst Temperatur) so anzupassen, dass die Hybridisierung der markierten Sonde ohne die mutierte DNA-Sequenz, die bei der Autoradiographie nachgewiesen werden kann, stabil ist.

Die Methode der ortsspezifischen Mutagenese ist besonders wertvoll, da sie die Isolierung von Mutationen ermöglicht, ohne deren phänotypische Manifestation zu kontrollieren. Diese Methode eröffnet neue Möglichkeiten zur Untersuchung der Funktionen regulatorischer Elemente von Genen, ermöglicht die Änderung der Stärke von Promotoren, die Optimierung von Ribosomenbindungsstellen usw. Einer der Hauptnachteile dieser Methodik є Protein-Engineering.

Protein-Engineering. Unter diesen Begriffen versteht man eine Reihe methodischer Techniken, die es ermöglichen, ein Proteinmolekül durch direkte Einführung typspezifischer Mutationen in einem Strukturgen (ortsspezifische Mutagenese) und damit notwendige Substitutionen von Aminosäuren in der Primärstruktur des Proteins zu rekonstruieren. lk.

Lassen Sie uns ein Beispiel für den Aufbau aktiver Proteine und die Experimente von Fersht und Spivrobitniks mit dem Enzym Tyrosyl-tRNA-Synthetase im Bakterium Bacillus stearothermophilus zeigen. Analyse der nachfolgenden Substitutionen von Aminosäuren in deren aktivem Zentrum das Enzym, die die Bildung einer neuen Gruppe ermöglicht, die schwache Wasserbindungen vom Substrat herstellt, seine Sporidität zum Substrat färben kann. In diesem Fall wurde festgestellt, dass Threonin-51 (nimmt Position 51 in der Peptidfalte ein) eine lange und schwache Wasserbindung mit dem sauren Ring von Ribose eingeht, wenn es an Tyrosyladenylat gebunden wird. Gleichzeitig wurde festgestellt, dass Prolin in E. coli-Bakterien die gleiche Position einnimmt. Ortsspezifische Mutagenese des Gens, die die Struktur der Tyrosyl-tRNA-Synthetase von B. stearothermophilus anzeigt und einen Austausch ermöglicht thr-51→pro -51 im Peptid. Infolgedessen nahm die ATP-Bindung im aktiven Zentrum des Enzyms stark ab und die katalytische Aktivität erhöhte sich um das 25-fache.

Eine weitere, nicht minder bedeutende Anwendung der Proteinrekonstruktion, die von praktischer Bedeutung ist, ist die von Estell und den Autoren entwickelte Modifikation des Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisins. Subtilisine sind Serinproteinasen, die von Bakterien in die äußeren Medien sezerniert werden. Diese Enzyme werden von der biotechnologischen Industrie in großem Maßstab hergestellt und finden in verschiedenen Branchen breite Anwendung. Es gibt nur wenige Subtilisine und die proteolytische Aktivität nimmt in Gegenwart von Oxidationsmitteln, einschließlich Pulvern, stark ab. Die Rekonstruktion des BPN-Subtilisinmoleküls zielte darauf ab, es vor der chemischen Oxidation zu stabilisieren.

Frühe Experimente ergaben, dass Subtilisin in Gegenwart von Wasserperoxid die Aktivität aufgrund der Oxidation von überschüssigem Methionin-222, das in Wasserstoffsulfoxid umgewandelt wird, leicht verringert. Mithilfe ortsspezifischer Mutagenesemethoden gelang es, dieses überschüssige Methionin durch 19 Proteinaminosäuren zu ersetzen. Plasmide mit mutierten Genen wurden in Stämme mit Deletionen in ähnlichen Genen eingeführt und die Wirksamkeit der produzierten Subtilisine analysiert. Mutanten, die Serin und Alanin222 enthielten, erwiesen sich als recht stabil gegenüber Wasserstoffperoxid. Es wurde festgestellt, dass der aktivste Mutant überschüssiges Cystein-222 ausgleicht, dessen Aktivität 38 % höher war als die des Wildtyp-Stamms.

Eine ähnliche Methode wurde verwendet, um die Aktivität von b-Interferon zu fördern. Zu den weiteren Errungenschaften des Protein-Engineerings gehört die Untersuchung der transformierenden Aktivität von Onkoproteinen; Veränderung der Thermostabilität von Enzymen, beispielsweise Entfernung von thermolabilem Renin und thermostabiler a-Amylase; Erhöhte Effizienz der Insulinbindung an den Plasmamembranrezeptor durch Ersatz von Histidin durch Aspartat im 10-b-Lanzyug-Hormon sowie ohne andere Anwendungen. Viele Produkte des Protein Engineering haben bereits praktische Anwendung in Produktionsprozessen gefunden.

Kursarbeit

aus der Disziplin: Silsky Podar Biotechnologie

zum Thema: „Protein Engineering“

Eintrag Protein-Engineering

1 Konzepte des Protein-Engineerings. Entwicklungsgeschichte

2 Protein-Engineering-Strategien. Anwendung manipulierter Proteine. Status des Protein-Engineerings

1 Bibliotheken von Peptiden und Epitopen

2 Reporterproteine in Hybridproteinen

3 Maßnahmen zum Erreichen des Protein-Engineerings.

Visnovok

Referenzenliste

Aufsatz

Thema der Arbeit: Protein Engineering.

Schlüsselwörter: Biotechnologie, Gentechnik, Protein, genetischer Code, Gen, DNA, RNA, ATP, Peptide, Epitop.

Meta der Kursarbeit: Erlernen des Konzepts des „Protein-Engineerings“ und potenzieller Fähigkeiten und Vikoriztaniya.

Das Potenzial des Protein-Engineerings:

Durch die Änderung der Bedeutung der Bindung der umzuwandelnden Substanz, des Substrats, an das Enzym ist es möglich, die katalytische Effizienz der enzymatischen Reaktion zu fördern.

Durch Erhöhung der Stabilität des Proteins über einen weiten Temperaturbereich und des Säuregehalts der Mitte kann in der Lösung festgestellt werden, wo das Ausgangsprotein denaturiert und seine Aktivität verliert.

Durch die Schaffung von Proteinen, die in wasserfreien Stoffen funktionieren, ist es möglich, katalytische Reaktionen in nicht-physiologischen Köpfen zu fördern.

Durch die Veränderung des katalytischen Zentrums eines Enzyms können Sie dessen Spezifität erhöhen und die Anzahl unnötiger Nebenreaktionen reduzieren

Indem Sie die Stabilität des Proteins gegenüber den Enzymen erhöhen, die es abbauen, können Sie das Reinigungsverfahren vereinfachen.

Indem Sie das Protein so ersetzen, dass es ohne die essentielle Aminosäurekomponente (Vitamin, Metallatom usw.) funktionieren kann, können Sie es in vielen kontinuierlichen technologischen Prozessen verwenden.

Durch die Änderung der Struktur der regulatorischen Abschnitte des Enzyms ist es möglich, das Stadium seiner Galvanisierung mit dem Produkt der enzymatischen Reaktion zum negativen Reaktionsgemisch zu ändern und dadurch die Ausbeute des Produkts zu erhöhen.

Es ist möglich, ein Hybridprotein zu erzeugen, das die Funktionen von zwei oder mehr Proteinen hat.

Sie können ein Hybridprotein erstellen, dessen Parzellen aus dem Hybridprotein der kultivierten Zelle aufgehellt oder aus der Summe gewonnen werden.

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Biotechnologie ist schon seit langem in der Lebensmittel- und Leichtindustrie von Bedeutung: in der Weinherstellung, in Backwaren, fermentierten Milchprodukten, in der Verarbeitung von Flachs und Schalen auf Basis gefrorener Mikroorganismen. Im letzten Jahrzehnt haben sich die Möglichkeiten der Biotechnologie enorm erweitert. Dies liegt daran, dass ihre Methoden aus dem einfachen Grund wichtig sind, weil in lebenden Organismen biochemische Reaktionen, die durch Enzyme katalysiert werden, über den optimalen Bereich (Temperatur und Laster) hinausgehen, produktiver, umweltfreundlicher sind und keine chemischen Reagenzien enthalten , Was soll man in der Mitte abreißen?

Zu den Objekten der Biotechnologie zählen zahlreiche Vertreter von Gruppen lebender Organismen – Mikroorganismen (Viren, Bakterien, Protozoen, Hefepilze), Pflanzen, Lebewesen sowie deren isolierte Zellen und subzelluläre Bestandteile (Organellen) und Enzyme. Die Biotechnologie basiert auf physiologischen und biochemischen Prozessen, die in lebenden Systemen ablaufen und zu sichtbarer Energie, Synthese und Abbau von Stoffwechselprodukten sowie zur Bildung chemischer und struktureller Komponenten von Litini führen.

Das Hauptaugenmerk der Biotechnologie liegt auf der Produktion zusätzlicher Mikroorganismen und kultivierter eukaryotischer Zellen, biologisch aktiver Verbindungen (Enzyme, Vitamine, Hormone), Medikamenten (Antibiotika, Impfstoffe, Sirupe, hochspezifische Antikörper usw.) sowie wertvoller Verbindungen (Futtermittel). Zusatzstoffe, Aminosäuren, Futterproteine etc.).

Gentechnische Methoden haben es ermöglicht, in Nutztieren Hormone wie Insulin und Somatotropin (Wachstumshormon) zu synthetisieren, die für die Behandlung genetisch bedingter Krankheiten beim Menschen notwendig sind.

Die Biotechnologie hängt nicht nur von der spezifischen Wissenschaft und Produktion ab. Es gibt eine größere globale methodische Aufgabe – sie erweitert und beschleunigt das Ausmaß des Zustroms von Menschen in die belebte Natur und bringt die Anpassung lebender Systeme an die Köpfe lebender Menschen und dann an die Noosphäre. Die Biotechnologie fungiert auf diese Weise als aktives Mittel der anthropogenen adaptiven Evolution.

Biotechnologie, Gen- und Zelltechnik haben vielversprechende Perspektiven. Mit dem Aufkommen immer neuer Vektoren können Menschen mit ihrer Hilfe die notwendigen Gene in der Kultur von Pflanzen, Tieren und Menschen fördern. Dies wird es den Menschen ermöglichen, sich nach und nach von einer Vielzahl von Krankheiten zu erholen, Gewebe zu durchmischen und essentielle Proteine und biologisch aktive Substanzen sowie dann Proteine und essentielle Aminosäuren zu synthetisieren, die in mein Leben integriert werden. Mithilfe vikoristischer Methoden, die die Natur bereits beherrscht, beginnen Biotechnologen damit, Wasser für zusätzliche Photosynthese zurückzugewinnen – umweltfreundliche Verbrennung von Wasser und Strom sowie die Umwandlung von Luftstickstoff in Ammoniak für außergewöhnliche Köpfe.

Die physikalischen und chemischen Kräfte natürlicher Proteine befriedigen oft nicht den Geist, in dem diese Proteine als Stellvertreter des Menschen dienen. Es ist notwendig, seine Primärstruktur zu ändern, um die Bildung des Proteins mit einer anderen, niedrigeren vorherigen Struktur und neuen physikalischen und chemischen Eigenschaften sicherzustellen, die es anderen Vorstellungen zufolge ermöglichen würden, die Kraft der natürlichen Proteinfunktionen zu verlieren. Protein Engineering beschäftigt sich mit dem Design von Proteinen.

Ein weiterer Bereich des Protein-Engineerings ist die Schaffung von Proteinen, die Substanzen und Mikroorganismen neutralisieren können, die als Quellen für chemische und biologische Angriffe genutzt werden können. Beispielsweise werden Hydrolase-Enzyme hergestellt, um sowohl Nervengase als auch Pestizide zu zersetzen, die in der Landwirtschaft eingesetzt werden. In diesem Fall ist die Produktion, Konservierung und Produktion von Enzymen nicht unsicher für die Umwelt und die Gesundheit der Menschen.

Um das veränderte Protein zu isolieren, werden Methoden der kombinatorischen Chemie und direkte Mutagenese eingesetzt, bei der spezifische Änderungen an der kodierenden DNA-Sequenz vorgenommen werden, was zu spezifischen Änderungen in den Aminosäuresequenzen führt. Für die effektive Gestaltung eines Proteins auf der Grundlage der gegebenen Eigenschaften ist es notwendig, die Bildungsmuster der räumlichen Struktur des Proteins zu kennen, die seinen physikalischen und chemischen Eigenschaften und Funktionen zugrunde liegen, also ist es notwendig zu wissen, was die primäre Funktion ist Die Struktur des Proteins, sein Aminosäureüberschuss fließt in die Kraft und Funktion des Proteins ein. Leider haben die meisten Proteine eine unbekannte Tertiärstruktur, was sich bald herausstellen wird. Sowohl die Aminosäure selbst als auch die Reihenfolge der Aminosäuren müssen geändert werden, um das Protein mit der erforderlichen Stärke zu extrahieren. Heutzutage ist es mit Hilfe der Computeranalyse möglich, den Gehalt an reichhaltigen Proteinen anhand der Reihenfolge ihrer Aminosäureüberschüsse vorherzusagen. Eine solche Analyse vereinfacht das Verfahren zur Herstellung der erforderlichen Proteine. Um Veränderungen in Proteinen mit der erforderlichen Kraft zu beseitigen, ist es zunächst wichtig, einen anderen Weg einzuschlagen: eine Reihe mutierter Gene zu eliminieren und das Proteinprodukt eines von ihnen zu finden, das die erforderliche Kraft hat.

Für die direkte Mutagenese werden unterschiedliche experimentelle Ansätze verwendet. Nachdem die Veränderungen im Gen entfernt wurden, wird es aus dem genetischen Konstrukt erzeugt und in prokaryotische oder eukaryotische Zellen eingeführt, um die Synthese des vom genetischen Konstrukt kodierten Proteins zu fördern.

I. Protein-Engineering

1 Konzepte des Protein-Engineerings. Entwicklungsgeschichte

Protein Engineering ist ein Zweig der Biotechnologie, der sich mit der Entwicklung von Proteinen und wertvollen Proteinen beschäftigt. Hierbei handelt es sich um eine völlig neue Disziplin, deren Ziel es ist, die Faltung von Proteinen sowie die Prinzipien der Modifikation und Zusammensetzung von Proteinen zu untersuchen.

Es gibt zwei Hauptstrategien für das Protein-Engineering: direkte Proteinmodifikation und direkte Evolution. Diese Methoden schließen sich gegenseitig aus; Pre-Detektive werden oft beleidigt. Ein detaillierteres Wissen über die Struktur und Funktion von Proteinen sowie Fortschritte in der Hochtechnologie können die Möglichkeiten des Protein-Engineerings erheblich erweitern. Dadurch können unnatürliche Aminosäuren in eine neue Methode einbezogen werden, die es ermöglicht, neue Aminosäuren in den genetischen Code aufzunehmen.

Das Protein-Engineering hat seinen Ursprung in der Proteinphysik, der Proteinchemie und der Gentechnik. Dabei handelt es sich um die Schaffung modifizierter und hybrider Proteinmoleküle mit spezifischen Eigenschaften. Der natürliche Weg, eine solche Aufgabe umzusetzen, besteht darin, die Struktur des Gens zu übertragen, das Veränderungen in Proteinen kodiert, wodurch dessen Synthese, Klonierung und Expression in Empfängerzellen verbessert wird.

Die erste kontrollierte Proteinmodifikation wurde Mitte der 60er Jahre von Koshland und Bender durchgeführt. Um die Hydroxylgruppe durch eine Sulfhydrylgruppe im aktiven Zentrum der Protease Subtilisin zu ersetzen, wurde eine chemische Modifikationsmethode verwendet. Es war jedoch klar, dass ein solches Thiolsubtilisin die Proteaseaktivität nicht bewahrt.

Ein chemisch hergestelltes Protein weist denselben Molekültyp auf, beispielsweise eine Polyaminosäureverbindung oder ein Polymer. Bestehend aus Aminosäuresequenzen von 20 Typen. Nachdem man die Natur von Proteinen erkannt hatte, fragte man sich: Wie können wir völlig neue Aminosäuresequenzen entwerfen, damit sie die notwendigen menschlichen Funktionen effizienter erfüllen können als die ursprünglichen Proteine? Diese Idee nennt sich Protein Engineering.

Bereits in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts begann man über solche Technik zu sprechen. Dies geschah unmittelbar nach der Entschlüsselung der ersten Protein-Aminosäuresequenzen. Zahlreiche Laboratorien auf der ganzen Welt haben begonnen, an der Nachbildung der Natur und der chemischen Synthese mit absolut ausreichenden Polyaminosäuresequenzen zu arbeiten.

Den größten Anteil an diesem Erfolg hat der Chemiker B. Merrifield. Damit gelang es den Amerikanern, eine hochwirksame Methode zur Synthese von Polyaminosäurelanzen zu entwickeln. Merrifield erhielt 1984 den Nobelpreis für Chemie.

Malyunok 1. Schema der Funktionsweise des Protein-Engineerings

Der Amerikaner begann mit der Synthese kurzer Peptide, darunter Hormone. Dabei handelte es sich um einen Automaten – einen „chemischen Roboter“ – dessen Aufgabe es war, einzelne Proteine in Schwingung zu versetzen. Der Roboter sorgte in der Wissenschaft für Aufsehen. Es war jedoch klar, dass seine Produkte nicht mit der Entwicklung der Natur mithalten können.

Der Roboter war nicht in der Lage, Aminosäuresequenzen genau zu erstellen, also würde er Gnade zeigen. Wir synthetisieren eine Lanze mit einer Sequenz und ändern die andere in nur wenigen Minuten. In einer Zelle sind alle Moleküle eines Proteins einander vollkommen ähnlich, ihre Sequenzen sind also absolut gleich.

Es gab ein anderes Problem. Allerdings erhielten die Moleküle, die der Roboter korrekt synthetisierte, nicht die gleiche räumliche Form, die für die Funktion des Enzyms notwendig ist. Daher hatte der Versuch, die Natur mit den fortschrittlichsten Methoden der organischen Chemie zu untergraben, nur bescheidenen Erfolg.

Es war der Natur unmöglich, mit der Entwicklung notwendiger Modifikationen von Proteinen zu beginnen. Hier kommt es in der Natur immer wieder zu Mutationen, die zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz von Proteinen führen. Wenn man Mutanten mit den nötigen Kräften auswählt, die ein anderes Substrat effektiver umwandeln können, dann kann man aus einem solchen Mutanten ein Enzym sehen, das neue Kräfte produziert. Dieser Vorgang dauert ziemlich lange.

Alles änderte sich, als die Gentechnik Einzug hielt. Sie begannen, aus jeder Nukleotidsequenz einzigartige Gene zu erzeugen. Diese Gene wurden bei der Herstellung von Vektormolekülen verwendet und diese DNA wurde in Bakterien und Hefen produziert. Dort wurde eine Kopie der RNA eines einzigartigen Gens entnommen. Dadurch ging das benötigte Protein verloren. Die Vorteile meiner Synthese wurden ausgeschaltet. Golovnya, es war notwendig, die erforderliche DNA-Sequenz auszuwählen, und dann arbeitete das Enzymsystem der Zelle selbst unbewusst von selbst. Auf diese Weise lässt sich die Idee entwickeln, dass die Gentechnik den Weg des Protein-Engineerings in seiner radikalsten Form erweitert hat.

1.2 Protein-Engineering-Strategien

Direkte Modifikation des Proteins. Bei der direkten Modifikation eines Proteins ist eine detaillierte Kenntnis der Struktur und Funktion des Proteins erforderlich, um die notwendigen Änderungen vorzunehmen. Diese Methode hat in der Regel den Vorteil, dass sie kostengünstig und technisch schwierig ist, da die Technik der ortsgerichteten Mutagenese gut etabliert ist. Sein größter Nachteil besteht jedoch darin, dass die Informationen über die berichtete Struktur eines Proteins oft begrenzt sind, und wenn die Struktur bekannt ist, kann es wichtig sein, den Zustrom verschiedener Mutationen zu übertragen.

Softwarealgorithmen zur Proteinmodifikation sollen neue Aminosäuresequenzen identifizieren, die wenig Energie benötigen, um eine neue Zielstruktur zu bilden. Da die zu findende Sequenz groß ist, besteht die größte Möglichkeit zur Modifikation des Proteins darin, bei der Änderung ähnlicher suboptimaler Sequenzen schnell und genau die optimale Sequenz zu identifizieren und zu bestimmen.

Die Evolution wurde gerade ausgerichtet. Bei der direkten Evolution wird ausreichende Mutagenese auf Protein konzentriert und eine Selektion durchgeführt, um Varianten auszuwählen, die wahrscheinlich singen. Weitere Mutations- und Selektionsrunden werden fortgesetzt. Diese Methode hat eine natürliche Entwicklung und ermöglicht es Ihnen, wundersame Ergebnisse für die direkte Modifikation zu erzielen.

Eine weitere Methode, das so genannte DNA-Shuffling, mischt und enthüllt Teile verschiedener Varianten, um die kürzesten Ergebnisse zu eliminieren. Dieser Prozess beinhaltet eine Rekombination, die auf natürliche Weise im Verlauf der statistischen Reproduktion auftritt. Der Vorteil der direkten Evolution besteht darin, dass keine fortgeschrittenen Kenntnisse über die Struktur des Proteins erforderlich sind und es nicht notwendig ist, vorherzusagen, welche Art von Mutation auftreten wird. Tatsächlich zeigen die Ergebnisse von Experimenten zur direkten Evolution, dass die Fragmente der Fruchtveränderung häufig zu Mutationen führen, die für einen solchen Effekt nicht verantwortlich sind. Allerdings erreicht diese Methode einen hohen Durchsatz, der nicht für alle Proteine möglich ist. Eine große Menge rekombinanter DNA ist wahrscheinlich mutiert und es ist notwendig, die Produkte auf Defekte zu untersuchen. Die große Anzahl an Optionen erfordert oft die Anschaffung von Robotern, um den Prozess zu automatisieren. Darüber hinaus ist es nie einfach, nach etwaigen Mängeln zu suchen.

II. Anwendungen von manipulierten Proteinen

Protein-Engineering kann auf der chemischen Modifikation des fertigen Proteins oder auf gentechnischen Methoden basieren, die es ermöglichen, modifizierte Varianten natürlicher Proteine zu isolieren.

Das Design eines biologischen Katalysators basiert auf der Spezifität des Proteins und der katalytischen Aktivität des metallorganischen Komplexes. Der Schwerpunkt der Anwendung solcher Modifikationen lag auf der Entfernung synthetischer bioorganischer Komplexe. Das vom Pottwal produzierte Myoglobin bindet Säure, besitzt aber keine biokatalytische Aktivität. Durch die Kombination von Biomolekülen mit drei Elektronentransferkomplexen, die Ruthenium entfernen, das mit überschüssigem Histidin auf der Oberfläche von Proteinmolekülen verbunden ist, entsteht ein Komplex, der über Nacht eine Reihe oxidierter organischer Substrate wie Ascorbat sauer macht. aufgrund solcher g, wie für natürliche Ascorbatoxidase. Prinzipiell können Proteine auch auf andere Weise verändert werden. Schauen wir uns zum Beispiel Papain an. Es ist notwendig, gute proteolytische Enzyme zu entwickeln, für die eine triviale Struktur angegeben ist. In der Nähe des überschüssigen Cystein-25 bildet sich auf der Oberfläche des Proteinmoleküls eine lange Furche, in der die Proteolysereaktion stattfindet. Diese Parzelle kann mit ähnlichen Flavinen alkyliert werden, ohne dass sich die Verfügbarkeit der Parzelle zur Bindung potenzieller Substrate ändert. Solche modifizierten Flavopapine wurden für die Oxidation von M-Alkyl-1,4-dihydronicotinamiden verwendet, und die katalytische Aktivität einiger dieser modifizierten Proteine war der natürlicher Proteine ähnlich. Flavoprotein-NADH-Dehydrogenase. Mit dieser Methode konnte ein sehr wirksames synthetisches Enzym geschaffen werden. Die Kombination hochaktiver Flavine, die in ihren elektronenextrahierenden Wirkstoffen enthalten sind, kann die Entwicklung wirksamer Katalysatoren für die Aufwertung von Nikotinamid ermöglichen.

Die großen Erfolge, die kürzlich bei der chemischen Synthese von DNA erzielt wurden, haben neue Möglichkeiten für das Protein-Engineering eröffnet: das Design einzigartiger Proteine, die in der Natur nicht konvergieren. Dafür ist eine Weiterentwicklung der Technik notwendig, damit die Veränderung von Genen mit gentechnischen Methoden zur Übertragung von Proteinveränderungen, zur Verbesserung einer ganzen Reihe funktioneller Eigenschaften führt: Drehzahl, km für ein bestimmtes Substrat, Thermostabilität, Temperaturoptimum, Stabilität und Aktivität in nichtwässrigen Mitteln, Substrat- und Reaktionsspezifität, Cofaktorbedarf, pH-Optimum, Resistenz gegenüber Proteasen, allosterische Regulierung, Molekulargewicht und Untereinheitengehalt. Um diese Steigerung zu erreichen, erreichten wir zusätzliche Mutagenese und Selektion und schließlich chemische Modifikation und Immobilisierung. Um eine bestimmte Art von Proteinmolekülen erfolgreich zu entwerfen, ist es notwendig, eine Reihe grundlegender Muster zu identifizieren, die die strukturellen Merkmale von Proteinen und ihre Energiegrundlagen in Beziehung setzen. Wenn man also die genaue Kristallstruktur des verarbeiteten Proteinmoleküls kennt, ist es möglich, diejenigen Abschnitte zu identifizieren, die direkt modifiziert werden können, um seine katalytische Aktivität zu erhöhen. Eine solche Modifikation kann eine Änderung der Aminosäuresequenz des Proteins beinhalten.

Eine andere Methode könnte die ortsspezifische Mutagenese sein. Auf diese Weise wird Wein zubereitet. Klonen Sie das Gen des Proteins, das im Nachkommen reproduziert werden soll, und züchten Sie es in einem ähnlichen genetischen Träger. Anschließend synthetisiert man einen Oligonukleotidprimer mit einer einzelnen Mutation, dessen Sequenz aus zehn bis fünfzehn Nukleotiden hinreichend homolog zur einzelnen Teilung des natürlichen Gens ist und so mit diesem eine Hybridstruktur erzeugt. Dieser synthetische Primer wird in Polymerasen umgewandelt, um die Synthese einer komplementären Kopie des Vektors zu initiieren, die dann zum Original hinzugefügt und in eine kontrollierte Synthese des mutierten Proteins umgewandelt wird. Ein alternativer Ansatz basiert auf einer gespaltenen Lanze, die an der Stelle entfernt wird, die Veränderungen fördert, und durch ein synthetisches Analogon mit der erforderlichen Nukleotidsequenz ersetzt wird.

Tyrosyl-tRNA-Synthetase katalysiert die Aminoacylierungsreaktion von Tyrosin-tRNA, die die Aktivierung von Tyrosin mit Hilfe von ATP und Tyrosyladenylat beinhaltet. Das Gen dieses Enzyms wurde in Bacillus stearothermophilus und im Bakteriophagen M13 beobachtet. Anschließend wurde die katalytische Kraft des Enzyms, insbesondere seine Fähigkeit, das Substrat zu binden, durch ortsspezifische Modifikation verändert. Daher wurde Threonin-51 durch Alanin ersetzt. Dies führte zu einer erhöhten Bindung an das Substrat, möglicherweise aufgrund der Unfähigkeit, eine Wasserbindung zwischen diesem Überschuss und Tyrosyladenylat auszubilden. Beim Ersetzen von Alanin durch Prolin wird die Konfiguration des Enzymmoleküls gestört, aber die Fähigkeit, an das Substrat zu binden, erhöht sich um das Hundertfache, da seine Wechselwirkung mit Histidin-48 einfacher wird. Solche ortsspezifischen Veränderungen wurden aus der p-Lactamase entfernt und gingen daher mit einer Inaktivierung des Enzyms einher. Der Ersatz von Serin-70 durch Cystein führt zur Bildung von p-Thiollactamase, deren Bindungskonstante sich nicht von der des natürlichen Enzyms unterscheidet, deren Aktivität gegenüber Penicillin jedoch weniger als 1-2 % beträgt. Die Aktivität dieses mutierten Enzyms gegen aktive Cephalosporine ist nicht geringer als die Aktivität des Maiskolbens bzw. übertrifft diese; Diese Proteine sind auch resistent gegen Proteasen.

Mutationen, die mit einem ortsspezifischen Zustrom verbunden sind, werden heute verwendet, um die Angemessenheit der Ergebnisse von Strukturstudien zu überprüfen. In einigen Fällen konnte gezeigt werden, dass die strukturelle Stabilität des Proteins und seine katalytische Aktivität gestört sein können. Es liegen ausreichend Informationen über die Wechselwirkungen zwischen der Stabilität der Proteinstruktur und ihrer Funktion vor, die zur Feinregulierung der Aktivität biologischer Katalysatoren beitragen und vollständig synthetische Analoga schaffen können. Kürzlich erschien eine Studie, die über die Klonierung des ersten synthetischen Gens für das Enzym berichtete, das das aktive Fragment des Ribonuklease-Moleküls kodiert.

III. Status des Protein-Engineerings

Einer der beliebtesten Bereiche des Protein-Engineerings ist die Veränderung der katalytischen Wirkung von Enzymen bei der Entwicklung „umweltfreundlicher“ industrieller Prozesse. Unter dem Gesichtspunkt des Schutzes überschüssiger Medien sind Enzyme von allen Katalysatoren in der Industrie am besten geeignet. Dadurch wird sichergestellt, dass die Biokatalysatoren in Wasser beginnen und in einem Medium mit neutralem pH-Wert und bei relativ niedrigen Temperaturen ihre volle Wirkung entfalten. Darüber hinaus entstehen trotz ihrer hohen Spezifität durch die Stagnation der Biokatalysatoren nur sehr wenige unnötige Nebenprodukte. Umweltfreundliche und energiesparende Industrieprozesse, die Biokatalysatoren verwenden, werden seit langem in der Chemie-, Textil-, Pharma-, Zellstoff-, Papier-, Gruben-, Energie- und anderen Bereichen der aktuellen Industrie aktiv vermarktet. i.

Allerdings sind die Eigenschaften von Biokatalysatoren in einer Reihe von Fällen unerwünscht. Beispielsweise zerfallen die meisten Enzyme mit zunehmender Temperatur. In den innovativsten Köpfen wird nun versucht, solche Defekte zu beheben und die Stabilität von Enzymen durch Protein-Engineering-Methoden zu erhöhen.

Zusätzlich zur industriellen Stagnation hat das Protein-Engineering seinen Platz in der medizinischen Forschung gefunden. Nachkommen synthetisieren Proteine, die an Viren und mutierte Gene binden, die Flusen produzieren, und zeshkozhuvat sie; Es werden hochwirksame Impfstoffe entwickelt, die Rezeptorproteine auf der Zelloberfläche einbeziehen, die oft Angriffspunkte für Arzneimittel sind. Frühere Unternehmen, die sich mit der Entwicklung von Lebensmitteln befassen, nutzen Protein-Engineering, um den Proteingehalt zu reduzieren, was die Konservierung pflanzlicher Produkte sowie gelatineartiger Substanzen und Snacks gewährleistet.

3.1 Bibliotheken von Peptiden und Epitopen

In einem lebenden Organismus werden die meisten biologischen Prozesse durch spezifische Protein-Protein- oder Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen gesteuert. Zu diesen Prozessen zählen beispielsweise die Regulation der Gentranskription unter dem Einfluss verschiedener Proteinfaktoren, die Interaktion von Proteinliganden mit Rezeptoren auf der Zelloberfläche sowie die spezifische Antigenbindung und damit verbundene Antikörper. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der Wechselwirkung zwischen Proteinliganden und Rezeptoren ist von großer grundlegender und angewandter Bedeutung. Zokrema, die Entwicklung neuer Medikamente mit Proteincharakter, beginnt mit der Identifizierung der Ausgangssequenz von Aminosäuren, die die notwendige biologische Aktivität aufweisen (die sogenannte „Leit“-Position). Allerdings können Peptide mit der Hauptaminosäuresequenz unerwünschte biologische Wirkungen haben: geringe Aktivität, Toxizität, geringe Stabilität im Körper usw.

Vor dem Aufkommen der Peptidbibliotheken erfolgte die Entwicklung ihrer biologischen Autorität durch die sequentielle Synthese einer großen Anzahl von Analoga und die Überprüfung ihrer biologischen Aktivität, was einen großen Zeit- und Geldaufwand erforderte. c. Endlich war es möglich, mithilfe automatischer Synthesizer in kurzer Zeit Tausende verschiedener Peptide herzustellen. Fortschrittliche Methoden der direkten Mutagenese haben es außerdem ermöglicht, die Anzahl der Proteine, die gleichzeitig eingefangen und konsistent auf biologische Aktivität getestet werden können, drastisch zu erhöhen. Jüngste Ansätze zur Erstellung von Peptidbibliotheken haben jedoch zur Identifizierung von Millionen von Aminosäuresequenzen geführt, die für ein effektives Screening erforderlich sind, um die mittleren Peptide zu identifizieren, die maximale Zufriedenheit bieten. Kriterien, die hängen bleiben. Solche Bibliotheken werden entwickelt, um die Wechselwirkung von Antikörpern mit Antigenen zu überwachen, neue Enzyminhibitoren und antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren, Moleküle zu entwerfen, die möglicherweise die erforderliche biologische Aktivität aufweisen, oder um Proteinen, beispielsweise Antikörpern, neue Kräfte zu verleihen.

Basierend auf den Erfassungsmethoden werden Peptidbibliotheken in drei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe kann Bibliotheken umfassen, die aus der chemischen Synthese von Peptiden stammen, in denen einzelne Peptide auf Mikronasen immobilisiert sind. Bei diesem Ansatz werden nach der Zugabe von Wurmaminosäuren in einzelnen Reaktionsmischungen zu den auf Mikronasen immobilisierten Peptiden statt aller Reaktionsmischungen diese kombiniert und in neuen Portionen verwendet, die im Frühstadium der Aufnahme neuer Aminosäureüberschüsse genutzt werden. Nach Durchführung geringer Mengen solcher Stufen werden Peptide synthetisiert, was die Abfolge von Mängeln bei der Synthese von Aminosäuren in verschiedenen Arten von Verbindungen ersetzt.

Bibliotheken von auf Mikronasen immobilisierten Peptiden sind Mangelware: Sie können beim Screening vikoristisch gereinigter Rezeptoren, die in einer Nebenform vorliegen, gesehen werden. Gleichzeitig wird in den meisten Fällen bei biologischen Tests, die für grundlegende und pharmakologische Studien durchgeführt werden, am häufigsten festgestellt, dass die mit Membranen verbundenen Rezeptoren stagnieren. Alternativ können Peptidbibliotheken mithilfe der Festphasen-Peptidsynthese getrennt werden. Dabei werden Wurmaminosäuren chemisch an Peptidproteine im Hautstadium angefügt, sodass diese in äquimolaren Mengen wachsen und sich bilden können. und alle oder alle Vorläuferaminosäuren. Im letzten Stadium der Synthese werden die Peptide dann aus der Nase verstärkt. in gewöhnliche Form übersetzt. Der dritte Ansatz zum Aufbau von Peptidbibliotheken, den wir nun beschreiben, ist zu einer echten Weiterentwicklung gentechnischer Methoden geworden. Vine veranschaulicht auf wundersame Weise die Machbarkeit solcher Methoden und zweifellos die großen Erfolge, die sie erzielt haben. In diesem Zusammenhang werden wir uns die berichteten Ergebnisse der Untersuchung von Peptidbibliotheken in den untersuchten Epitopen (antigenen Determinanten) von Proteinen ansehen.

Die gentechnische Technologie zur Entfernung von Hybridproteinen hat es ermöglicht, eine wirksame Methode zur Herstellung kurzer Peptide für die Analyse ihrer biologischen Aktivität zu entwickeln. Sowie eine große Anzahl von Genbibliotheken, Bibliotheken von Peptiden, die durch gentechnische Methoden ausgewählt wurden, und ein großer (oft erschöpfender) Satz kurzer Peptide. Zwei kürzlich entwickelte Ansätze ermöglichen es, eine Peptidbibliothek gleichzeitig als eine Bibliothek von Proteinepitopen zu betrachten. Erstens können kurze Peptide alle wichtigen überschüssigen Aminosäuren enthalten, die eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit Antikörpern spielen, und sie können wichtige antigene Determinanten von Proteinen haben. Mit anderen Worten: In den meisten Fällen entstehen nichtkovalente Bindungen zwischen den wichtigsten überschüssigen Aminosäuren der Proteinliganden und ihren Rezeptoren, wodurch die Hauptbeiträge der Zündenergie zum Liganden-Rezeptor gegenseitig verringert werden. Betrachtet man es, kann jedes Peptid als potenzieller Ligand, als Hapten oder als Teil der antigenen Determinante großer Polypeptide angesehen werden, und jede Peptidbibliothek kann als Bibliothek von Epitopen von Proteinen oder potenziellen Proteinen angesehen werden. Ganten für spezifische Proteinrezeptoren .

Bibliotheken von Peptiden und Epitopen finden ihre Anhäufung bei der Erforschung der Mechanismen des humoralen Immunsystems sowie der Erkrankung des Immunsystems. Laut Zokrem gehen die meisten Autoimmunerkrankungen mit der Entwicklung von Autoantikörpern gegen Antigene im Körper einher. Diese Antikörper sind in vielen Fällen spezifische Marker für andere Autoimmunerkrankungen. Grundsätzlich ist es möglich, Peptidmarker aus einer vielfältigen Epitopbibliothek zu identifizieren, darüber hinaus wäre es möglich, die Spezifität von Autoantikörpern während der Entwicklung eines pathologischen Prozesses sowohl in einem einzelnen Organismus als auch in Patientengruppen zu überwachen und, Darüber hinaus bestimmen Sie die Spezifität von Autoantikörpern bei Erkrankungen unbekannter Ätiologie.

Bibliotheken von Peptiden und Epitopen können möglicherweise auch zum Screening von Immunseren verwendet werden, indem Peptide identifiziert werden, die spezifisch mit chemischen Antikörpern interagieren. Solche Peptide haben antigene Determinanten gegen pathogene Organismen und dienen als Angriffspunkte für chemische Antikörper im Körper. Es ist möglich, ähnliche Peptide zur Impfung von Patienten zu verwenden, die keine Antikörper gegen ähnliche Krankheitserreger produzieren. Die Untersuchung von Epitopen mit Hilfe von Peptidbibliotheken wird durch das Erscheinen einer ihrer zahlreichen Richtungen in der angewandten und Grundlagenforschung zur Interaktion von Liganden und Rezeptoren ergänzt. Eine weitere Verfeinerung dieses Ansatzes könnte zur Entwicklung neuer Medikamente führen, die auf kurzen Peptiden basieren und auf Grundlagenforschung zu den Mechanismen von Protein-Protein-Wechselwirkungen basieren.

3.2 Reporterproteine in Hybridproteinen

In anderen Fällen werden Hybridproteine verwendet, um aufgrund der Stabilisierung dieser Peptide bei der Lagerung von Hybridproteinen ein hohes Maß an Expression kurzer Peptide in Bakterienzellen zu erreichen. Hybridproteine werden häufig zur Identifizierung und Reinigung wichtiger rekombinanter Proteine verwendet. Wenn beispielsweise der C-Terminus des verfolgten Proteins als Galactosidase-Reporterprotein erreicht ist, ist es möglich, das rekombinante Protein auf Galactosidase-Aktivität, also antigene Determinanten, durch immunchemische Methoden zu reinigen. Durch die Kombination von DNA-Fragmenten, die offene Leserahmen (ORFs) mit Reporterprotein-Genen kombinieren, ist es möglich, solche Hybridproteine auf Reporterproteinaktivität zu reinigen und sie gezielt für die Immunisierung von Labortieren einzusetzen. Die Antikörper wurden entfernt und zur Reinigung des nativen Proteins stehen gelassen, das das vom ORF kodierte rekombinante Polypeptid enthält. Anschließend wird das klonierte Genfragment identifiziert.

Mit Hilfe von Hybridproteinen wird die Aufgabe gelöst, ein unbekanntes Gen zu klonen, dessen Proteinprodukt ein Antikörper ist. In diesem Fall wird eine Bibliothek von Nukleotidsequenzen erstellt, die den ORF unbekannter Gene in Vektoren darstellt, die es ermöglichen, den klonierten ORF im gleichen Leserahmen wie das Reportergen zu verbinden. Hybridproteine, die durch die Expression dieser rekombinanten Gene entstehen, werden mit zusätzlichen Antikörpern durch enzymgebundene Immunosorbens-Methoden identifiziert. Gbridni Geni, Shodnoye-Sekretär Bilki I Bilki-Berichte, geben Sie eine neue doslіjuvati mechanisiert aus zweiter Hand, und so eine Heuschrecke bewege ich in Stoffen Bilkiw, ShO Secret.

3.3 Die Reichweite des Protein-Engineerings

Durch den Ersatz einer großen Anzahl von Aminosäureüberschüssen durch Lysozym des T4-Bakteriophagen durch Cystein wurde ein Enzym mit einer großen Anzahl von Disulfidbindungen entfernt, weshalb dieses Enzym seine Aktivität bei einer höheren Temperatur beibehielt.

Zamyna Zalishka Cystein auf Zalushka Serina im Molekül R-Interferon Lyni, die Synthese wird mit einer Palette mit einer Palette synthetisiert und die Entfernung der Wunder der Molekülkomplexe, und der aktive Bolzen des Zyago-Lіkarsky-Bolzens wurde von besucht 10 mal.

Der Ersatz des überschüssigen Threonins durch überschüssiges Prolin im Molekül des Enzyms Tyrosyl-tRNA-Synthetase steigerte die katalytische Aktivität dieses Enzyms um ein Vielfaches: Es begann, Tyrosin schnell an die tRNA anzuhängen, die diese Aminosäure während der Translation auf das Ribosom überträgt ii.

Subtilisine sind serinreiche Enzyme, die Proteine abbauen. Der Gestank wird von einer Vielzahl von Bakterien abgesondert und von Menschen häufig zum biologischen Abbau missbraucht. Es ist wichtig, Calciumatome zu binden, um seine Stabilität zu erhöhen. Allerdings kommt es in industriellen Prozessen zu chemischen Reaktionen, die Kalzium binden, woraufhin Subtilisine ihre Aktivität verlieren. Nachdem sie das Gen verändert hatten, entfernten sie nun Aminosäuren aus dem Enzym, die an der Kalziumbindung beteiligt sind, und ersetzten eine Aminosäure durch eine andere, indem sie die Stabilität von Subtilisin erhöhten. Das veränderte Enzym erwies sich in industrienahen Köpfen als stabil und funktionell aktiv.

Es wurde die Fähigkeit gezeigt, ein Enzym zu erzeugen, das als Restriktionsenzym fungiert und DNA an genau festgelegten Stellen abbaut. Sie schufen ein Hybridprotein, von dem ein Fragment die Sequenz überschüssiger Nukleotide im DNA-Molekül erkannte und das andere die DNA desselben Fragments spaltete.

Gewebeplasminogenaktivator ist ein Enzym, das klinisch zur Auflösung von Blutgerinnseln eingesetzt wird. Leider wird es schnell aus dem Blutkreislauf ausgeschieden und muss erneut oder in großen Dosen verabreicht werden, was zu Nebenwirkungen führen kann. Durch die Einführung von drei direkten Mutationen in das Gen dieses Enzyms haben wir das langlebige Enzym eliminiert, das eine fortgeschrittene Sporidität zu Fibrin aufweist, was zu der gleichen fibrinolytischen Aktivität wie das Ausgangsenzym führt.

Durch den Austausch einer Aminosäure im Insulinmolekül konnte nun erreicht werden, dass bei subkutaner Gabe dieses Hormons bei Diabetikern die Konzentration dieses Hormons im Blut verändert wurde. Sie kommt dem physiologischen Wert nach dem Essen nahe .

Es gibt drei Klassen von Interferonen, die antivirale und krebshemmende Wirkung haben, aber unterschiedliche Spezifität aufweisen. Es wäre verlockend, ein Hybrid-Interferon zu entwickeln, das die Wirkung von drei Arten von Interferonen hätte. Es wurden Hybridgene geschaffen, die Fragmente verschiedener Arten natürlicher Interferon-Gene enthielten. Einige dieser Gene sorgten durch die Aufnahme in Bakterienzellen für die Synthese von Hybrid-Interferonen mit größerer Antikrebsaktivität, die geringer war als die der Moleküle meines Vaters.

Das natürliche Wachstumshormon des Menschen bindet nicht nur an den Rezeptor für dieses Hormon, sondern auch an den Rezeptor für ein anderes Hormon – Prolaktin. Um unnötige Nebenwirkungen während des Behandlungsprozesses zu vermeiden, wurde es für möglich gehalten, dem Prolaktinrezeptor Wachstumshormon hinzuzufügen. Dies gelang ihnen, indem sie mit Hilfe der Gentechnik mehrere Aminosäuren in der Primärstruktur des Wachstumshormons ersetzten.

Anti-VIL-Infektionsmittel haben nun ein Hybridprotein entfernt, von dem ein Fragment die spezifische Bindung dieses Proteins an mit dem Virus infizierte Lymphozyten gewährleistet, das andere Fragment dringt in das Hybridprotein in der Mitte der geschädigten Zelle ein und ein weiteres Fragment zerstört Proteinsynthese in der geschädigten Zelle und Tod.

Proteine sind die wichtigste Methode für medizinische Zwecke. Es gibt etwa 500 Angriffsziele. In naher Zukunft wird ihre Zahl auf 10.000 steigen, was uns die Schaffung neuer, effektiver und sicherer Systeme ermöglichen wird. Gleichzeitig werden grundlegend neue Ansätze zur Suche nach medizinischen Eigenschaften entwickelt: Ziel sind nicht einzelne Proteine, sondern deren Komplexe, Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteinfaltungen.

Visnovok

Protein-Engineering-Technologie wird eingesetzt (oft in Kombination mit rekombinanter DNA), um die Leistungsfähigkeit natürlicher Proteine (Enzyme, Antikörper, Zellrezeptoren) zu steigern und neue Proteine zu schaffen – und das, was sich die Natur nicht vorstellen kann. Solche Proteine werden zur Herstellung medizinischer Präparate, bei der Verarbeitung von Madenprodukten und in der industriellen Produktion verwendet.

Proteinmodifikation, technische Mutagenese

Referenzenliste

1. Protein-Engineering.

2. Protein-Engineering. Geheimnisse der Genetik. / Vyacheslav Markin // Geheimnisse, Geheimnisse, Fakten.

Protein-Engineering. //Große russische Enzyklopädie.

Protein-Engineering. // Dovidnik khimika 21.

Protein-Engineering und Proteineffizienz.

Protein-Engineering. / K.I. Kornelyuk//Biopolymere und Zellen.

Protein Engineering verbessert die Wirksamkeit von Proteinen. // Beliebte Mechanik.

Protein-Engineering. Obsession mit Insulin. // Biofile ist ein Wissenschafts- und Informationsmagazin.

Biotechnologie. Die Hauptrichtungen und Reichweite. // Biologie für Bewerber und Leser.

Bogdanov A.A., Mednikov B.M. Vlada nad gene/A. A. Bogdanov, B.M. Mednikov - M.: Prosvitnitstvo, 1989 - S.208

Gentechnik. // Gesund.

Genies und Chemiker. // Genetik.

13. Glik B., Pasternak J. Molekulare Biotechnologie. Prinzipien und zastosuvannya / B. Glik, J. Pasternak. - M: Svit, 2002.

14. Andere Probleme der Gentechnik. / L.V. Timoschenka, M.V. Chubik // Medizin – neue Technologien.

15. Egorova T.A., Klunova S.M., Zhivukhin E.A. Grundlagen der Biotechnologie. / T.A. Egorova, S.M. Klunova, E.A. Schiwukhin - M., 2003.

16. Protein-Engineering. // Chemie und Biotechnologie.

17. Patrushev L.I. Expression von Genen/L.I. Patrushev – M.: Nauka, 2000. – 496 S.

Patruschew L.I. Stück genetische Systeme. T. 1: Gen- und Protein-Engineering. / L.I. Patrushev – M.: Nauka, 2004. – 526 S.

Ribchin V.M. Grundlagen der Gentechnik: Handbuch für Universitäten/V.M. Ribchin - St. Petersburg: Ansicht von SPbDTU, 2002. - 522 S.

Stepanov V.M. Molekularbiologie Strukturen und Funktionen von Proteinen. / V.M. Stepanov - M.: Vishcha-Schule, 1996.

Biotechnologische Technologien: Protein-Engineering, Nanobiotechnologie, Biosensoren und Biochips. / Evgeniya Ryabtseva // „Kommerzielle Biotechnologie“ – Online-Magazin.

Chernavsky D.S., Chernavska N.M. Belok-Maschine. Biologische makromolekulare Strukturen. / D.S. Chernavsky, N. M. Chernavska - M: Ansicht von MDU, 1999.

Schultz G.E., Schirmer R.H. Prinzipien der strukturellen Organisation von Proteinen. / G.Ye. Schultz, R.H. Schirmer - M.: Svit, 1982.

24. Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Protein-Engineering 20 Jahre später // Nature Reviews. Molekulare Zellbiologie. 2002. Bd. 3. Nr. 12;

25.Protein-Engineering. // Wikipedia, freie Enzyklopädie.

Nach Überlegungen zur Eliminierung ortsspezifischer Mutationen ist es notwendig, nur einen Schritt zu tun, um sofort aus den Turbulenzen der Molekulargenetik, dem sogenannten Protein-Engineering, herauszukommen. Tatsächlich hat die Entwicklung direkter Mutagenesemethoden es ermöglicht, Proteine mit hoher Präzision zu modifizieren, ihre Struktur-Funktions-Beziehungen zu identifizieren und neue Proteine wie in der Natur zu konstruieren. Das auffälligste Ergebnis dieses Ansatzes sind Hybridproteine, die auf der Kombination von Fragmenten und funktionellen Domänen verschiedener Polypeptidproteine mit verschiedenen gentechnischen Methoden basieren.

Eine weitere vielversprechende Richtung des Protein-Engineerings ist die Entwicklung biologisch aktiver Peptide mit pharmakologischer Aktivität.

Bibliotheken von Peptiden und Epitopen

Bibliotheken von auf Mikronasen immobilisierten Peptiden sind Mangelware: Sie können beim Screening vikoristisch gereinigter Rezeptoren, die in einer Nebenform vorliegen, gesehen werden. Gleichzeitig wird in den meisten Fällen bei biologischen Tests, die für grundlegende und pharmakologische Studien durchgeführt werden, am häufigsten festgestellt, dass die mit Membranen verbundenen Rezeptoren stagnieren. Alternativ können Peptidbibliotheken mithilfe der Festphasen-Peptidsynthese getrennt werden. Dabei werden Wurmaminosäuren chemisch an Peptidproteine im Hautstadium angefügt, sodass diese in äquimolaren Mengen wachsen und sich bilden können. und alle oder alle Vorläuferaminosäuren. Im letzten Stadium der Synthese werden die Peptide dann aus der Nase verstärkt. in gewöhnliche Form übersetzt. Der dritte Ansatz zum Aufbau von Peptidbibliotheken, den wir nun beschreiben, ist zu einer echten Weiterentwicklung gentechnischer Methoden geworden. Vine veranschaulicht auf wundersame Weise die Machbarkeit solcher Methoden und zweifellos die großen Erfolge, die sie erzielt haben. In diesem Zusammenhang werden wir uns den Bericht über die Ergebnisse der Untersuchung von Peptidbibliotheken in der Forschung ansehen Epitope(antigene Determinanten-)Proteine.

Die gentechnische Technologie zur Entfernung von Hybridproteinen hat es ermöglicht, eine wirksame Methode zur Herstellung kurzer Peptide für die Analyse ihrer biologischen Aktivität zu entwickeln. Sowie eine große Anzahl von Genbibliotheken, Bibliotheken von Peptiden, die durch gentechnische Methoden ausgewählt wurden, und ein großer (oft erschöpfender) Satz kurzer Peptide. Zwei aktuelle Fortschritte ermöglichen es, eine Peptidbibliothek gleichzeitig als eine Bibliothek von Proteinepitopen zu betrachten. Erstens können kurze Peptide alle wichtigen überschüssigen Aminosäuren enthalten, die eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit Antikörpern spielen, und sie können wichtige antigene Determinanten von Proteinen haben. Mit anderen Worten: In den meisten Fällen entstehen nichtkovalente Bindungen zwischen den wichtigsten überschüssigen Aminosäuren der Proteinliganden und ihren Rezeptoren, wodurch die Hauptbeiträge der Zündenergie zwischen Ligand und Rezeptor gegenseitig verringert werden. Betrachtet man es, kann jedes Peptid als potenzieller Ligand, Hapten oder Teil der antigenen Determinante großer Polypeptide angesehen werden, und eine Peptidbibliothek kann als Bibliothek von Epitopen von Proteinen oder potenziellen Proteinen betrachtet werden. Ganten für spezifische Proteinrezeptoren .

Klein II.19. Schema der Expression von Peptidepitopen auf der Oberfläche der Membran fadenförmiger Coliphagen.

Peptidepitope befinden sich im Lager von Hybrid-Polypeptid-Lanjugs des Nebenproteins pIII ( A) oder das Hauptprotein pVIII der Virushülle ( B). Die Pfeile zeigen die Positionen der Epitope von Oligonukleotidfragmenten im Bakteriophagengenom sowie die Positionen der Epitope selbst an. Die Speicherung des pIII-Polypeptids ( A) Es wird nur eine Kopie des Epitops angezeigt (tatsächlich beträgt ihre Anzahl 4–5)

Die Peptidbibliothek, die als Ergebnis der Implementierung des dritten Ansatzes destilliert wurde, scheint derzeit eine Sammlung von Dutzenden oder Hunderten Millionen kurzer Sequenzen zu sein, die verschiedene Aminosäuren wie Express auf der Oberfläche von Bakteriophagen-Virionen in der Nähe des Speichers ausdrücken ihrer Feuchtigkeitsstrukturproteine. Mittlerweile ist es möglich, mithilfe gentechnischer Methoden hybride rekombinante Gene in das Genom von Bakteriophagen einzuführen, um Veränderungen in den Strukturproteinen ihrer Virionen zu kodieren. (Diese Methode heißt Phagen-Display.) Durch die Expression solcher Gene entstehen Hybridproteine, an deren N- oder C-terminalen Enden (unten) sich zusätzliche Aminosäuresequenzen befinden. Im am weitesten entwickelten System, das den Aufbau von Peptidbibliotheken mit gentechnischen Methoden ermöglicht, werden der kleine filamentartige Coliphagen f1 und zwei Proteine isoliert: die Haupt- und Nebenmembranproteine pVIII und pIII. In vivo werden Proteinproteine in Form von Polypeptidlanzen mit kurzen N-terminalen Signalsequenzen synthetisiert, die während ihrer Reifung durch Signalpeptidase gespalten und in den inneren Teil der Bakterienmembran übertragen werden. Während des Sammelvorgangs werden reife Proteine in die Bakteriophagenmembran eingeführt. In diesem Fall bildet das Protein pVIII die Haupthülle des Bakteriophagen, sodass entweder fünf pIII-Moleküle mit dem terminalen Teil des Virions verbunden sind und die Interaktion von Viruspartikeln mit den Zustandszotten von E. coli-Zellen gewährleisten ( Abb. II. 19). Mit gentechnischen Methoden werden Peptide mit Proteinen verbunden – direkt von ihren N-terminalen Sequenzen oder in geringem Abstand. Die terminalen Sequenzen der meisten Proteine sind größer und liegen in der Regel auf der Oberfläche der Kügelchen frei, was die Aufnahme hybrider rekombinanter Proteine ohne Zerstörung ihrer Hauptproteinstrukturen ermöglicht und außerdem integrierte Peptide für die Ruferkennung verfügbar macht. Darüber hinaus ermöglicht die Struktur der Peptide selbst in dieser Position und Geräumigkeit einen geringeren Zustrom von Proteinträgern. Während der Experimente wurde festgestellt, dass die Einführung fremder Peptide in den N-terminalen Teil des pIII-Proteins die Lebensfähigkeit und Infektiosität von Phagenpartikeln nicht wesentlich beeinflusst, während die Verbindung von Peptiden dies nur bei Überschüssen von >5 Aminosäuren bewirkt Der N-terminale Teil des Proteins pVIII stört die Faltung von Virionen. Die verbleibende Schwierigkeit kann überwunden werden, indem Wildtyp-pVIII-Proteinmoleküle an die Stelle der Virionsammlung gebracht werden, deren Synthese direkt durch das Subgen-Gen des parasitären Virus vermittelt wird. Bei dieser Variante ist die Hülle des Bakteriophagen sowohl für veränderte pVIII-Proteine als auch für Wildtyp-Polypeptide des Wirtsvirus anfällig.

Klein II.20. Schema zur Konstruktion eines rekombinanten viralen Genoms, um die Insertion generativer Oligonukleotide zum Aufbau einer Epitopbibliothek zu ermöglichen

Dvolanzyuzhkovy-Oligonukleotid ( A), um die mutierten NNK-Codons und die gleichen Restriktionsstellen im Linker-Lager unterzubringen, ligiert an die DNA des Fuse5-Vektors ( B), durch Restriktionsenzym gespalten Sfi Ich, mit der Entwicklung des rekombinanten Genoms ( V), bei dem es sich um die direkte Synthese eines hybriden rekombinanten Proteins handelt ( G), wobei die Aminosäuresequenz dem N-Terminus zugeordnet ist

Beim Aufbau einer Peptidbibliothek synthetisieren wir zunächst zwei komplementäre Oligonukleotide, die dann das Peptidmolekül erzeugen, dessen zentraler Teil das Peptid kodiert (Abb. II.20, A), und die an den Enden hervorstehenden einspurigen Segmente sind komplementär zu den „klebrigen“ Enden des Vektors, die unter der Wirkung eines kontinuierlichen Restriktionsenzyms freigesetzt werden (div. Abb. II.20, B).

Um die Aminosäuren von Peptiden zu kodieren, verwenden wir abgeleitete Codons der Form NNK oder NNS, die alle Nukleotide (N) in der ersten und anderen Positionen, G oder T (K) und auch G oder C (S) in der Position umfassen dritter Platz. Aufgrund des natürlichen genetischen Codes befinden sich bei diesem Ansatz Informationen über alle 20 Aminosäuren und ein Stoppcodon in 32 verschiedenen Codons NNK und NNS und nicht in 64.

Im Prozess der Synthese generierter Oligonukleotide, die weitere Peptide kodieren, werden im Hautstadium einzelne Nukleotide für die Codons invarianter Aminosäuren erzeugt, die den variablen Teil des Peptids flankieren, sowie äquimolare Nukleotidsummen für die Abschnitte, die vorhanden sind kodieren Sie die spezifischen Sequenzen. Ein Satz generierter Oligonukleotide, die, nachdem sie als Ergebnis etabliert wurden, in Form von einspurigen Fragmenten an den spezifischen Stellen des Bakteriophagen-Membranprotein-Gens im Lager des Phagenvektors oder Phasmids weiter kloniert werden. Eine Alternative für einen solchen Satz von Oligonukleotiden (chemisch oder mit Hilfe von PLR) besteht darin, komplementäre Lants zu synthetisieren, die Inosin in variablen Abschnitten enthalten, deren übrig gebliebene Fragmente offenbar mit den Basen der C- und T-Matrix paaren, die wird hinterlegt. Zwischen den entsprechenden Oligonen werden die richtigen Duplexe erzeugt. Nach der Erstellung werden die Oligonukleotide mit spezifischen Restriktionsenzymen verdaut und in einen Phagenvektor kloniert. Rekombinante Pidbag-Moleküle (div. Abb. II.20, V) DNA wird in Bakterienzellen eingeführt, wodurch ~10 9 Transformanten pro 1 mg rekombinanter DNA entfernt werden, etablierte Phagenpartikel sich in Bakterien vermehren und nach der Reinigung das Vorhandensein rekombinanter Peptide überwachen (div. Abb. II.20, G), spezifische Wechselwirkungen mit Tracking-Rezeptoren in Proteinen ihrer Virionen.

Die Anzahl der einzelnen Phagenklone in einer Bibliothek ist für ihren Vicor anfänglich. Beispielsweise ist eine Bibliothek, die mögliche Hexapeptide enthält, dafür verantwortlich, dass sie 64 Millionen (20 6) verschiedene sechsgliedrige Aminosäuresequenzen enthält, die von ~1 Milliarde (32 6) verschiedenen Hexacodons kodiert werden (32 ist die Anzahl der Codons, vorher mit). Mit dessen Hilfe können Sie kodieren, ob 20 Aminosäuren allgemeiner synthetisiert werden oder nicht, und auch mit bösartigen Codons (NNK oder NNS). Um diese Aufgabe zu erfüllen, können auch große Bibliotheken entfernt werden, so dass beispielsweise 2 · 10 8 – 3 · 10 8 einzelne Bibliotheksklone, unabhängige Klone, und der Wert 10 9 ist derzeit die Obergrenze für die Anzahl einzelner Bibliotheksklone, die praktisch ausgewählt werden können.

Auf dieser Grundlage können Sie ein System erstellen, das den Überschuss an Peptiden maximiert, das alle möglichen Ergänzungen von 20 Aminosäuren umfasst, die mit Hilfe zusätzlicher Peptidbibliotheken verwendet werden können, wodurch ein Überschuss von 6 Aminosäuren entsteht. Es ist nicht weniger wichtig zu beachten, dass eine Bibliothek aus 15-gliedrigen Peptiden gleicher Größe (2–3 × 10 8 Klone) größer ist als verschiedene Hexapeptide; eine Bibliothek aus 6-gliedrigen Peptiden wird im Folgenden betrachtet. c. Da die Anzahl der überschüssigen Aminosäuren in einem Peptid außerdem effektiv seine biologische Aktivität anzeigt, kann eine Bibliothek aus 15-gliedrigen Peptiden repräsentativ für eine Bibliothek erscheinen, die größer ist als kurze Peptide mit der gleichen Anzahl von Klonen.

Klein II.21. Schema zur Auswahl von Phagenpartikeln, die die notwendigen Epitope enthalten

Es werden drei rekombinante Phagenpartikel gezeigt, die unterschiedliche Epitope im pIII-Lager exprimieren. Nur das Epitop des zentralen Phagenteils wird von einem Molekül eines biotinylierten Antikörpers erkannt, der mit Hilfe von Streptavidin und Vicoristan für das Bibliotheksscreening auf einer Petrischale immobilisiert wurde.

Um gefundene Peptide mit biologischer Aktivität aus der Bibliothek zu identifizieren, müssen unterschiedliche Screening-Methoden eingesetzt werden. Zocrema, zum Nachweis von Peptiden, die Song-Epitope aufweisen, vikoristische biotinylierte monoklonale Antikörper einer spezifischen Spezifität, die auf einem harten Pad mit zusätzlichem Ogo-Streptavidin immobilisiert sind (Abb. II.21). Phagenpartikel, die ähnliche Epitope auf ihrer Oberfläche exprimieren, interagieren mit Antikörpern und werden mit einer Auskleidung bedeckt, sodass andere rekombinante Phagenpartikel während des Prozessbads entfernt werden. Anschließend werden die auf der Auskleidung gefangenen Phagenpartikel mit Säure eluiert, einzelne Klone in Bakterienzellen weiter vermehrt und die darauf exprimierten Epitope werden verschiedenen Kriterien unterzogen. Das Vorhandensein identischer oder ähnlicher Nukleotidsequenzen in der Mitte der klonierten Sequenzen weist auf die Spezifität des Reinigungsprozesses hin. Einzelne Klone werden dann durch andere Methoden charakterisiert, einschließlich Immunenzymmethoden. Im letzten Untersuchungsstadium erfolgt die Synthese der identifizierten Peptide und deren vollständige Verarbeitung im gereinigten Zustand.

Derzeit gibt es Informationen über die durchgeführten Arbeiten an Peptidbibliotheken. In einer solchen Bibliotheksstudie wurden Peptide entdeckt, deren Aminosäuresequenzen sich stark von der Aminosäuresequenz des wahren Epitops des überwachten Antigens unterschieden. Das Timing ist nicht weniger wichtig, ein solches Peptid bindet eng an spezifische Antikörper und konkurriert um die Bindung an ein natürliches Antigen. Dadurch konnten wir Erkenntnisse über die Möglichkeit von Schlaf entwickeln Mimotope- kurze Peptide mit natürlichen Epitopen, deren Aminosäuresequenzen sich stark voneinander unterscheiden. Es war möglich, die kanonischen Sequenzen von Aminosäuren von Peptiden zu ermitteln, die Epitope natürlicher Proteine aufweisen, und unter ihnen Aminosäurereste zu identifizieren, die eine Schlüsselrolle bei der Interaktion zwischen Antigen und Antikörper spielen.

Einer der reichhaltigsten Beiträge von Peptidbibliotheken ist die Identifizierung von Peptidliganden mit „strukturellen“ Epitopen, die auf der Oberfläche von Proteinkügelchen infolge der Verbrennung ihres Feldes entstehen. Peptidlanzen, die mit einer großen Nähe von Amino einhergehen Säureüberschüsse, die von Polypeptidüberschüssen getrennt werden. Mit Hilfe von Peptidbibliotheken ist es möglich, Analoga von Peptiden verschiedener Epitope nicht-proteinischer Natur zu identifizieren. Offensichtlich wird es in naher Zukunft möglich sein, Peptidbibliotheken zur Identifizierung neuer Medikamente, zur Entwicklung diagnostischer Methoden und zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe zu nutzen. In Galusa könnte die Entwicklung neuer Arzneimittel durch die Forscher auf die Schaffung von Peptidliganden ausgerichtet sein, die spezifisch mit Rezeptoren interagieren, was von medizinischem und biologischem Interesse ist. Die Kenntnis der Struktur solcher Liganden würde es einfacher machen, auf dieser Basis Nicht-Protein-Medikamente zu entwickeln.

In der untersuchten Literatur sind die übrigen Peptide kovalent an das Trägerprotein gebunden. Dieser Geruchstyp ist einer der Vertreter von Hybridproteinen, die durch gentechnische Methoden erzeugt werden.

In anderen Fällen werden Hybridproteine verwendet, um aufgrund der Stabilisierung dieser Peptide bei der Lagerung von Hybridproteinen ein hohes Maß an Expression kurzer Peptide in Bakterienzellen zu erreichen. Hybridproteine werden häufig zur Identifizierung und Reinigung wichtiger rekombinanter Proteine verwendet. Sobald man beispielsweise als α-Galaktosidase-Reporterprotein am C-Terminus des verfolgten Proteins angekommen ist, ist es möglich, das rekombinante Protein mit schonenden Methoden auf die Aktivität der α-Galaktosidase, d. h. antigener Determinanten des Immunsystems, zu reinigen . Durch die Kombination von DNA-Fragmenten, die offene Leserahmen (ORFs) mit Reporterprotein-Genen kombinieren, ist es möglich, solche Hybridproteine auf Reporterproteinaktivität zu reinigen und sie gezielt für die Immunisierung von Labortieren einzusetzen. Die Antikörper wurden entfernt und zur Reinigung des nativen Proteins stehen gelassen, das das vom ORF kodierte rekombinante Polypeptid enthält. Anschließend wird das klonierte Genfragment identifiziert.

Hybridtoxine

Serienwerke I. Pastana verdeutlicht mit der Entwicklung direkter Hybridtoxine die Leistungsfähigkeit des Protein-Engineerings durch die Kombination verschiedener funktioneller Domänen von Proteinen, um spezifische biologische Wirkungen zu erzielen.

Klein II.22. Direkt wirkende Arzneimittelpräparate auf Basis von Hybridtoxinen

A- Das Strukturdiagramm des Arzneimittels mit direkter Wirkung wurde aktualisiert; B- Budova pseudomonas-Toxin (Zahlen geben die Position des Aminosäureüberschusses an); V– Budova-Hybridtoxin; G– Hybridtoxin auf Basis monoklonaler Antikörper

Die ideale medizinische Behandlung einer ganz bestimmten Wahl ergibt sich aus den zugrunde liegenden strukturellen und funktionellen Merkmalen (Abb. II.22, A). Ein solches Medikament muss den aktiven Kolben binden, um eine physiologische Wirkung zu erzielen, und einen Liganden, der den Rezeptor auf der Oberfläche der Zielzellen erkennt. Darüber hinaus sind die Strukturelemente, die vom Transportsystem des Körpers erkannt werden, auch für die Zufuhr von Flüssigkeiten zu den Zielzellen verantwortlich, ebenso wie der Abstandsabschnitt, der die Trennung des nächsten Ohrs von anderen Funktionen erfordert. Nationale Teile des Arzneimittels nach der Lieferung an die Adresse. Dieses ideale Schema wird im natürlichen Exotoxin Pseudomonas aeruginosa umgesetzt. Exotoxin A P. aeruginosa ist ein Protein, das aus einer Polypeptidkette von 613 Aminosäuren besteht, die in drei funktionelle Domänen organisiert ist (div. Abb. II.22, B). Die N-terminale Domäne Ia (Aminosäurereste 1–252) ist für die Interaktion mit der Oberfläche von Zielzellen (dem Prototyp des idealen Liganden mit direkter Wirkung) erforderlich. Die Funktionen der Domäne Ib (Aminosäurereste 365–404) sind unbekannt. Domäne II (Aminosäurereserven 253–364) gewährleistet den effektiven Transfer des Toxins in das Zytosol (lytisches Transportsystem) und Domäne III (Aminosäurereserven 405–613) erleichtert die ADP-Ribosylierung des Translationsverlängerungsfaktors. ї EF2, mit dem die Übertragung von Zielen unterdrückt werden soll. Damit die zytotoxische Wirkung von Exotoxin A auftritt, ist es daher notwendig, dass die Domäne Ia den Rezeptor auf der Zelloberfläche erkennt, durch durch Rezeptoren vermittelte Endozytose in die Zellen eindringt und dann durch die innere Membran in das Zytosol transloziert, d. h. delokalisiert Faktor EF2 heißt. Die Hauptidee bei der Schaffung direkter Toxine bestand darin, die Domäne Ia durch einen anderen Peptidliganden zu ersetzen, der mit einer anderen Gruppe von Rezeptoren auf der Zelloberfläche interagiert und dadurch die Spezifität verändert. Die Reinheit dieses Toxins ähnelt der der Zellen selbst (div . Abb. II. 22, V).

Es wurde festgestellt, dass die Entfernung der Domäne Ia durch gentechnische Methoden die Toxizität eines solchen verkürzten Proteins sowohl in Zellen verschiedener Abstammungslinien als auch in vivo deutlich (hunderte und tausende Male) verringert. Durch Hinzufügen des C-terminalen Teils des verkürzten Polypeptids des Interleukin-Moleküls konnten zwei Personen die Strukturteile der Subtyp-Gene in einem exprimierenden Vektor kombinieren. Das Hybridtoxin erwies sich als äußerst giftig, da die Zellen, die Interleukin-2-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche tragen, nicht auf die Zellen einwirkten, deren Rezeptoren einen Tag lang dem natürlichen Toxin ausgesetzt waren. Verinnerlichung(Translokation zwischen Zellen) des Hybridtoxins wird durch die p55- und p70-Untereinheiten des Interleukin-2-Rezeptors vermittelt. Aufgrund der Wirkung des Hybridtoxins auf die Zellpopulation werden einige von ihnen auf ihrer Oberfläche exprimiert Die Rezeptoren für Interleukin 2 führen zum selektiven Absterben dieser Zellen selbst.

Im Körper exprimieren die meisten ruhenden T-Zellen und Gedächtnis-T-Zellen keine hochaffinen Interleukin-2-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, daher wirken T-Zellen, stimuliert durch Alloantigene, auf solche Rezeptoren. Daher reduzierte die interne Verabreichung eines Hybridtoxins bei Patienten mit experimenteller Arthritis – Krankheiten, die durch pathologische Aktivierung von T-Clitinen verursacht werden – die Krankheitssymptome. Das Hybridtoxin veränderte die Transplantationsreaktion bei Mäusen deutlich.

Nach diesen bahnbrechenden Robotern gab es eine ganze Reihe von Studien, die sich mit der Entwicklung ähnlicher Systeme zur gezielten Abgabe verschiedener zytotoxischer Polypeptide befassten. Im Zuge der weiteren Verbesserung des Systems zur gezielten Abgabe von Pseudomonas-Toxin mit Interleukin 2 wurde festgestellt, dass der Ligand dauerhaft aus der Adressdomäne des Toxins entfernt und durch die Einführung von vier Toxin in die ortsspezifischen Genmutationen inaktiviert wurde . Es wurde festgestellt, dass Moleküle eines solchen Hybridtoxins 10- bis 100-mal wirksamere zytotoxische Wirkstoffe gegen menschliche Zellen und MAPs sind, die Rezeptoren für Interleukin 2 auf ihrer Oberfläche exprimieren, sowie eine etwas längere Trinkdauer im Blut und bei Mäusen in vivo hatten von einer zuvor entfernten Struktur repariert.

Basierend auf dem Pseudomonas-Toxin wurden Hybridtoxine geschaffen, die mit den Polypeptidliganden Interleukin 4, Interleukin 6, Transforming Growth Factor Typ A und Insulin-like Growth Factor I kombiniert wurden. Für alle diese Hybridproteine ist hochspezifisches Protein indiziert. ), die die Hauptrezeptoren sind. Das Vorhandensein eines Teils des CD4-Polypeptids im Hybridtoxin des Liganden – eines Glykoproteins auf der Oberfläche von T-Clitin, das der Rezeptor für das VIL-Virus ist und mit seinem Glykoprotein gp120 interagiert – ermöglichte eine Vibrationsinvasion infizierter T-Zellen mit dem VIL-Virus express2 auf ihrer Oberfläche.

Das gleiche Prinzip der Unterdrückung der durch HIV-Viren verursachten Infektion, die verschiedenen CD4-Rezeptoren, wird bei der Entwicklung von Hybridproteinen siegreich sein, die Teile der CD4-Polypeptid-Lanjugs mit den konstanten Teilen wichtiger oder Lungen-Lanjugs in Immunglobulin-Menschen kombinieren. Bei der Kombination von Genen wurden Nukleotidsequenzen entfernt, die die Transmembran- und Zytoplasmadomänen von CD4 sowie den variablen Teil der Polypeptid-Lanzinogene von Immunglobulinen kodieren. Die stabilisierten Hybridmoleküle werden aufgerufen Immunadhäsine Durch die Struktur des konstanten Teils des Immunglobulinmoleküls wurde eine erhöhte Stabilität im Körper erreicht und darüber hinaus blieben spezifische Kräfte erhalten, vermittelt durch die konstanten Teile von Immunglobulinen: die Verbindung von Fc-Rezeptor und Protein A, geschaffen vor der Fixierung durch das Komplement und wird durch die Plazentaschranke übertragen. Die Kombination all dieser Kräfte ermöglichte es Immunadhäsinen, die Infektion von T-Zellen mit dem HIV-I-Virus wirksam zu unterbrechen und sowohl das Virus selbst als auch die damit infizierten Zellen zu blockieren, die das Virus auf ihrer Oberfläche gp120-Antigen exprimieren.

Die Weiterentwicklung gentechnischer Konstrukte auf Basis von Pseudomonas-Exotoxin wurde möglich, nachdem bei zwei Personen im Adressteil des Hybridtoxins begonnen wurde, die variablen Domänen monoklonaler Antikörper in die p55-Komponente des Interleukinrezeptors umzuwandeln. In diesem rekombinanten Protein wurde mit Hilfe eines zusätzlichen 15-spurigen Peptid-Aminosäure-Linkers die variable Domäne des wichtigen Lancug-Immunglobulins mit der variablen Domäne der Lunge und der C-Terminus der Lunge mit N verbunden - Ende des verkürzten Pseudomonas-Toxins. G). Solche hybriden Toxinmoleküle erwiesen sich auch als hochspezifische zytotoxische Wirkstoffe menschlicher Leukämiezellen, die auf ihrer Oberfläche Interleukin-2-Rezeptoren exprimieren.

Ein umfassender Ansatz hat das Potenzial für die Entwicklung spezifischer Antikörper als gezielte Bestandteile von Hybridtoxinen aufgezeigt. Dadurch erhalten unsere Vorgänger eine universelle Methode zur gezielten Abgabe von Toxinen, die es uns ermöglichen könnte, jeder Gruppe von Zellen, die spezifische Antigene auf ihrer Oberfläche exprimieren, eine zytotoxische Wirkung zu verleihen. Erweitern Sie das Spektrum der Ziele für chemotherapeutische Wirkungen mithilfe bösartiger rekombinanter Proteine erheblich.

Die Creme aus Pseudomonas-Exotoxin A als Arbeitskolben in Hybridtoxinen wurde erfolgreich mit Diphtherietoxin, Papageientaucher-Nekrosefaktor und A-Lancinat-Ricin kombiniert. Fragmente von A-Proteinen interagieren vibrierend mit den konstanten (Fc) Teilen von Verbindungen, die reich an Immunglobulinen der Klasse G sind, wie z. B. einem mit Immunglobulin gepaarten Hybridtoxin, das gegen jedes Antigen auf der Oberfläche von Zellen isoliert wird, vibrierend mit diesen Zellen kommuniziert und sie tötet. Solche Immuntoxine sind ein weiteres potenzielles Antitumormittel und können gegen Zellen wirken, die spezifische Antigene auf ihrer Oberfläche exprimieren.

Klein II.23. Victory-Hybridprotein zur Regulierung der Genexpression

Gentechnische Methoden offenbaren die endlosen Möglichkeiten der Entwicklung neuer Proteine durch die Kombination verschiedener Kombinationen unterschiedlicher funktioneller Domänen von Polypeptidproteinen. Die Entfernung von Hybridtoxinen durch direkte Wirkung verdeutlicht das Potenzial dieses Ansatzes zur Proteintechnik. Als weitere Veranschaulichung der Leistungsfähigkeit dieser Methodengruppe betrachten wir das Hybridprotein als neuen Regulator der Genaktivität. Bei der gentechnischen Konstruktion eines solchen Proteins wurde die DNA-bindende Domäne des Glukokortikoidhormonrezeptors durch eine spezifische Domäne des E. coli-LexA-Repressors ersetzt (Abb. II.23).

Einführung der Operator-Gensequenz lexA in den Bereich des Promotors des Globin-Gens (oder anderer Gene) führte zur Aktivierung des Promotors unter dem Einfluss eines Hybridproteins in Gegenwart von Dexamethason – einem synthetischen Hormon, das mit dem Glukokortikoidrezeptor interagiert. Somit verfügt das neue Gen über eine präzise Sequenz von Nukleotiden des Genoperators lexA E. coli fungierte in Gegenwart eines Hybridaktivatorproteins, das anhand seiner Sequenz erkannt wird, als Transkriptionsverstärker. Die Ergebnisse des Roboters zeigen die Möglichkeit, durch die Kombination bekannter funktioneller Domänen neue Proteine – Regulatoren der Genaktivität – zu schaffen.

Die Entwicklung des Protein-Engineerings wird maßgeblich durch das begrenzte Wissen über strukturell-funktionale Zusammenhänge in Proteinen vorangetrieben, was zu einer Komplexität des Untersuchungsgegenstandes führt. Numerische Arbeiten zur Entwicklung solcher Bindungen sollen empirischer Natur sein und enden mit der Lokalisierung von Aminosäuren, den wesentlichen Funktionen der aktiven Zentren von Enzymen. Daher besteht die Hauptaufgabe des Protein-Engineerings darin, Protein entsprechend der Konsistenz von Aminosäureüberschüssen aus den gegebenen Behörden zu entfernen – erlaubt ist dies noch lange nicht. Es ist nicht weniger wahr, dass jetzt versucht wird, die Kraft natürlicher Enzyme direkt zu verändern, indem mithilfe der direkten Mutagenese eine kleine Menge überschüssiger Aminosäurepolypeptide ersetzt wird.