PROTEIN ENGINEERING, în special biologie moleculară și bioinginerie, care are ca scop schimbarea directă a structurii proteinelor naturale și extragerea de noi proteine din cele atribuite de autorități. Ingineria proteinelor a început la începutul anilor 1980, când au fost dezvoltate metode de inginerie genetică, care au făcut posibilă izolarea diferitelor proteine naturale din bacterii sau drojdii, precum și identificarea structurii genelor și, în consecință, a secvenței de aminoacizi (structura primară) a proteinelor care sunt codificate . Pe baza principiilor de organizare a moleculelor de proteine, interacțiunea dintre structura și funcția proteinelor, ingineria proteinelor creează o tehnologie bazată științific pentru schimbarea directă a structurii acestora. Cu ajutorul ingineriei suplimentare a proteinelor, este posibilă creșterea termostabilității proteinelor, rezistența acestora la infuzii care denaturază, agenții organici, modifică puterea de legare a liganzilor. Ingineria proteinelor permite înlocuirea aminoacizilor, îmbunătățirea funcționării enzimelor și specificitatea acestora, modificarea valorilor optime ale pH-ului la care operează enzima, oprirea activităților secundare inutile, reducerea Aceste molecule inhibă reacțiile enzimatice și promovează eficacitatea medicamentelor proteice. . De exemplu, înlocuirea unui singur exces de treonină cu un exces de alanină sau prolină a crescut activitatea enzimei tirosiltARN sintetazei de 50 de ori, iar prin înlocuirea a 8 excese de aminoacizi, așa-numita protează asemănătoare termolizinei cu Bacillus stearothermophilus, importanța de economisire a apărut2. Ingineria proteinelor poate fi efectuată și prin schimbarea directă a puterilor proteinelor cu modificări chimice suplimentare, cum ar fi introducerea de compuși fotoactivați care modifică puterile moleculelor în contact cu Este necesar să conectați semnele, care vă permit să fixați căile de mișcare. proteina din proteină sau direcționați-o către diferiți clienți componente și altele asemenea. Este important ca astfel de roboți să fie desfășurați pe proteine recombinante produse prin metode de inginerie genetică.
Există două tipuri de inginerie a proteinelor: proiectarea rațională și evoluția moleculară directă a proteinelor. În primul rând, apreciem disponibilitatea informațiilor despre informațiile structurale și funcționale din proteinele obținute prin metode fizico-chimice și biologice, precum și modelarea moleculară computerizată, astfel încât să putem. Depinde de dvs. să faceți orice modificări în structura primară la atinge rezultatul dorit. Astfel, pentru a crește termostabilitatea unei proteine, este necesar să se determine structura spațială a acesteia, să se identifice secțiuni „slabe” (de exemplu, aminoacizii care sunt insuficient legați de proprietățile lor) și să se selecteze cele mai bune opțiuni pentru ele Min pe alți aminoacizi. acizi pentru modelarea moleculară suplimentară și optimizarea parametrilor energetici ai moleculei; Apoi mutați gena, apoi îndepărtați și monitorizați proteina mutantă. Dacă această proteină nu îndeplinește parametrii specificați, efectuați o nouă analiză și repetați ciclul de descriere. Această abordare este folosită cel mai adesea în construcția de proteine personalizate (proteine de novo) în conformitate cu autoritățile specificate, atunci când intrarea conține o nouă secvență de aminoacizi, determinată în principal sau în întregime de oameni, iar rezultatul i este o moleculă de proteină cu caracteristicile necesare. . Deocamdată, însă, în acest fel este posibil să se izoleze mici proteine de novo cu o structură spațioasă incomodă și să se introducă în ele activități funcționale simple, de exemplu, părți metalice sau fragmente scurte de peptide care pot fi purtate de funcțiile personale ale biologilor.
La dirijarea evoluției moleculare a proteinelor, cu ajutorul metodelor de inginerie genetică, se izolează un set mare de gene mutante diferite ale întregii proteine, care apoi sunt exprimate într-un mod special, montate pe suprafața fagilor („fa govy display”. „) sau în celulele bacteriene, pentru a realiza o posibilă selecție a mutanților cu cele mai bune caracteristici. În acest fel, de exemplu, genele pentru proteina necesară sau părțile acesteia sunt generate de genomul fagului - până când gena care codifică proteina este depusă pe suprafața particulei de fag. În acest caz, fagul individual poartă propria sa proteină mutantă, care are puterea de a lupta împotriva alegerii. Genele mutante sunt identificate prin „amestecarea” unui set de gene de proteine naturale similare ale diferitelor organisme, de obicei folosind metoda suplimentară a reacției polimerazei Lanziug, astfel încât pielea care conține proteine mutante poate include un fragment și o mulțime de proteine „tatălui”. De fapt, această abordare are o evoluție naturală a proteinelor, sau într-un ritm semnificativ accelerat. Sarcina principală a unui inginer proteic în acest context constă în dezvoltarea unui sistem eficient care selectează pentru a permite selecția celor mai bune variante de proteine mutante cu parametrii necesari. În cazul unei sarcini mai importante - de a crește termostabilitatea proteinei - selecția poate fi efectuată, de exemplu, prin creșterea prezenței celulelor pentru a răzbuna genele mutante.iar proteina mutantă are o stabilitate termică mai mare).
Cele două denumiri ale direcțiilor de inginerie a proteinelor sunt similare și complementare una cu cealaltă. Astfel, urmărirea rezultatelor obținute folosind alte metode de evoluție moleculară a variantelor mutante de proteine ne permite să înțelegem mai bine organizarea structurală și funcțională a moleculelor proteice și să dobândim cunoștințe pentru reacții țintite ideale pentru proiectarea de noi proteine. Dezvoltarea ulterioară a ingineriei proteinelor face posibilă dezvoltarea multor aplicații practice pentru îmbunătățirea naturală și crearea de noi proteine pentru nevoile medicinei, agriculturii și biotehnologiei. Este posibil să se formeze proteine care îndeplinesc funcții necunoscute în natura vie.
Lit.: Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Ingineria proteinelor la 20 de ani // Nature Reviews. Biologie celulară moleculară. 2002. Vol. 3. Nr. 12; Patrushev L. I. Sisteme genetice ale piesei. M., 2004. T. 1: Ingineria genelor și proteinelor.
Metodele de inginerie genetică, inclusiv clonarea genelor individuale și a părților lor și secvențierea ADN-ului, au făcut posibilă îmbunătățirea semnificativă a metodologiei de mutageneză, eliminând principalele deficiențe ale mutațiilor metodelor clasice de inducție în genom. Analiza genetică clasică transferă afluxul unui factor mutagen in vivo către întregul genom, rezultând mutații aleatorii, adesea multiple, făcând dificilă identificarea mutanților. Identificarea indivizilor mutanți are loc datorită modificărilor caracterelor fenotipice, iar natura mutației poate fi determinată după secvențierea ADN-ului. Mutageneza de localizare contemporană, în esență, efectuează aceiași pași: clonează gena sau segmentul care urmează a fi donat, determina structura acesteia în timpul secvențierii și apoi face modificările necesare in vitro. Moștenirea mutației cauzate are loc după introducerea genei mutante în organismul țintă.
Cea mai simplă versiune a mutagenezei localizate implică prelevarea de probe a unui fragment de ADN donat cu unul dintre factorii mutageni, iar rezultatul unui astfel de influx va fi, de asemenea, schimbări rapide în structura fragmentului. Cele mai fiabile și mai frecvent utilizate metode de mutageneză localizată funcționează fără prezența factorilor mutageni. Dintre tipurile de mutații, delețiile, inserțiile și substituțiile de nucleotide sunt importante.
spre fund. Aceste tipuri de mutații în mutageneza localizată se bazează pe asistența endonucleazelor. Atât endonucleazele de restricție, cât și endonucleazele nespecifice acționează ca vicoriști. Cel mai simplu tip de enzimă de restricție apare în divizarea genomului cu ajutorul unei enzime de restricție suplimentare, care provoacă o serie de perturbări de la formarea capetelor lipicioase. Fragmentele îndepărtate sunt din nou închise la inelul din spatele ADN-ligazei suplimentare, ceea ce poate duce la formarea de molecule care nu înlocuiesc unul dintre segmentele de ADN. Cu această abordare, se formează deleții lungi și se efectuează mutațiile acestora, de obicei în experimentele timpurii, pentru a determina funcțiile unor secțiuni mari de ADN donat.
În acest fel, pot fi realizate mici ștergeri. Fragmentul de donare este scindat la locul de stocare a vectorului la locul specific folosind enzima de restricție (Fig. 21.1). Molecula liniară care a fost dizolvată este separată de exonuclează III, care hidrolizează o lance în depozitul de ADN,
incepand de la capatul 3'. Rezultatul este un set de molecule cu cozi 5' cu o singură bandă de lungime variabilă. Aceste cozi sunt hidrolizate de nucleaza S1, care este specifică pentru ADN-ul monocatenar, și se formează deleții de ADN. De asemenea, este posibilă activarea exonucleazei Bal 31, care catalizează degradarea ambelor molecule de ADN, începând de la capetele moleculelor liniare de ADN. Cursul reacțiilor nucleotice este reglat prin variarea orei de incubare, a temperaturii și a concentrației enzimei care induce ștergerea diferitelor proteine. Când se îndepărtează variantele de deleție ale ADN-ului liniar, linkerii sunt adesea adăugați înainte de ciclizare, astfel încât situsurile de restricție să fie prezente în regiunea deleției. Explorați alte modificări ale descrierilor acestor metode.
Inserție (inserții). Pentru a elimina inserțiile, ADN-ul donat este scindat cu o enzimă de restricție sau cu o endonuclează nespecifică și apoi sunt adăugate fragmente care sunt create în prezența segmentului care urmează să fie introdus în ADN. Cel mai adesea, astfel de segmente sunt sintetizate prin metoda chimică polilinkery (Capitolul 20).
Inserțiile, cum ar fi delețiile, pot distruge integritatea unei gene sau structura regiunilor sale reglatoare, în urma căreia o proteină defectuoasă va fi sintetizată (în cazul delețiilor lungi, cadrul de citire este de obicei inactiv) sau va fi prevenită. schimbați procesul de transcriere a genelor, deci faceți clic. În acest fel, mutanții regulatori sunt adesea izolați și vectorii sunt construiți pentru exprimare (Capitolul 20).
Mutații punctuale . Aceste mutații sunt înlocuirea nucleotidelor. Pentru a le elimina, pot fi utilizate o serie de abordări: deminarea citozinei, includerea analogilor de nucleotide, includerea incorectă a nucleotidelor în timpul reparării golului etc.
Prima metodă se bazează pe faptul că excesul de citozină din ADN-ul monocatenar poate fi dezaminat din uracil cu ajutorul bisulfitului și procesării ionilor. Fragmentele de ADN cu o singură bandă sunt generate în apropierea locurilor de restricție, de exemplu, în timpul acțiunii exonucleazei III. După tratarea rupțiilor unilaterale cu bisulfit, uitați de utilizarea ADN polimerazei și legarea capetelor. La locurile în care citidilatul este înlocuit cu uridilat dezaminat, adenilatul devine complementar și în timpul replicării unei astfel de molecule, perechea GC va fi înlocuită cu perechea AT.
O altă abordare pentru inducerea substituțiilor este utilizarea unei probe de ADN donat folosind un fel de enzimă de restricție în prezența bromurii de etidio, care apare între zonele perechilor de baze și perturbă structura duplexului. Ca rezultat, este creat ADN-ul monocatenar. La locul unei rupturi cu o singură catenă, creați o mică curățare și apoi uitați-o în prezența ADN polimerazei, dATP, dGTP, dCTP și N-4-hidroxicitozină trifosfat în loc de dTTP. Trifosfatul de hidroxicitozină este pornit pentru a înlocui timidilatul, dar în timpul replicării ADN-ului se împerechează mai bine atât cu adenilatul, cât și cu guanilatul. Ca rezultat al includerii guanilatului după runda suplimentară de replicare în acest site, va avea loc substituția AT→GC (Fig. 21.2). Fragmentele din această metodă de înlocuire a nucleotidelor apar la mijloc
de restricție, este posibil să se separe cu ușurință vectorii de secvența de ieșire și cei mutanți. Pentru a face acest lucru, este suficient să le digerați cu o enzimă de restricție, care este testată în experiment: moleculele mutante nu pot fi divizate.
O metodă similară de baze pe vicoristan cu doar trei din patru nucleotide posibile atunci când se umple o pauză monocatenară cu ADN polimerază. Cel mai adesea, enzima leagă moleculele acolo și se formează o nucleotidă complementară. Cu toate acestea, ADN polimeraza este modificată pentru a include una dintre cele trei nucleotide prezente. Acest lucru duce la formarea de molecule inelare, care conțin baze azotate incomplementare nepereche. Când astfel de vectori sunt introduși în celulele bacteriene, unele molecule vor suferi reparații ale unor astfel de daune. Ca rezultat, jumătate din molecule după replicare vor reveni la secvența de ieșire, iar în cealaltă jumătate mutația va fi fixată. Moleculele mutante pot fi izolate folosind metoda descrisă.
Mutageneză specifică locului. Metodele caracterizate de mutageneză localizată se disting prin faptul că locurile în care apar mutațiile sunt selectate aleatoriu. În același timp, tehnica mutagenezei site-specifice face posibilă introducerea mutațiilor într-o singură secțiune a unei gene. Funcționează cu o varietate de oligonucleotide sintetice (reduse prin sinteză chimică) cu o secvență dată. Metoda este simplă deoarece nu necesită site-uri de restricții manuale. Metoda se bazează pe crearea de heteroduplexuri între o oligonucleotidă sintetică pentru a preveni mutația și ADN-ul monocatenar complementar în stocarea vectorului.
Găsiți o astfel de cale. Sintetizați o mică oligonucleotidă (8-20 monomeri), complementară acestei părți a genei, pentru a elimina mutația. Depozitarea oligonucleotidei în secțiunea centrală permite una sau mai multe substituții de nucleotide. Clonarea genei urmărite sau a fragmentului acesteia din vectorul stoc pe baza fagului M13 pentru a conține ADN recombinant circular cu o singură bandă. Vectorii recombinanți cu oligonucleotide sunt amestecați și utilizați. Are loc hibridizarea oligonucleotidei cu regiunea complementară, iar nucleotidele necomplementare sunt eliminate din cele nepereche. Oligonucleotida joacă un rol ca primer pentru reacția polimerazei care implică ADN polimeraza in vitro. Inelele clipesc cu gaze. Molecula inelului îndepărtată este introdusă în celulele E. coli, prin care se realizează repararea parțială a replicării mutante. Frecvența mutațiilor variază de la 1 la 50%. Selecția celulelor pentru a înlocui moleculele de ADN mutante poate fi efectuată în mai multe moduri, printre care avantajele includ metoda de utilizare a unei oligonucleotide marcate radioactiv, care este stagnată pentru mutageneză. Această nucleotidă servește ca sondă. Principiul unei astfel de sonde se bazează pe faptul că este parțial complementar ADN-ului mutant și parțial complementar ADN-ului de tip sălbatic. Este posibil să se ajusteze astfel de hibridizări (în primul rând, temperatura) astfel încât hibridizarea sondei marcate să fie stabilă fără secvența ADN mutantă care poate fi detectată pe autoradiografie.
Metoda de mutageneză specifică locului este deosebit de valoroasă deoarece permite izolarea mutațiilor fără a controla manifestarea lor fenotipică. Această metodă deschide noi posibilități pentru studierea funcțiilor elementelor de reglare ale genelor, permite modificarea puterii promotorilor, optimizarea locurilor de legare a ribozomilor etc. Unul dintre principalele dezavantaje ale acestei metodologii є Ingineria proteinelor.
Ingineria proteinelor. Aceste cuvinte înseamnă un set de tehnici metodice care permit reconstrucția unei molecule proteice prin introducerea directă a mutațiilor specifice tipului într-o genă structurală (mutageneză specifică locului) și, prin urmare, substituții necesare de aminoacizi în structura primară a proteinei. lk.
Să arătăm un exemplu de construcție a proteinelor active și experimentele lui Fersht și spivrobitniks cu enzima tirozil-ARNt sintetaza din bacteria Bacillus stearothermophilus. Analiza substituțiilor ulterioare de aminoacizi în centrul activ al cărora enzima, permițând formarea unui nou grup care creează legături slabe de apă din substrat, își poate colora sporiditatea față de substrat. În acest caz, s-a dezvăluit că treonina-51 (ocupă poziția 51 în pliul peptidic) creează o legare lungă și slabă de apă cu inelul acid al ribozei atunci când este legată de adenilat de tirozil. În același timp, s-a dezvăluit că prolina ocupă aceeași poziție în bacteriile E.coli. Mutageneză specifică locului a genei, care indică structura tirozil-ARNt sintetazei B. stearothermophilus, permițând înlocuirea thr-51→pro -51în peptidă. Ca rezultat, legarea ATP în centrul activ al enzimei a scăzut brusc, iar activitatea catalitică a crescut de 25 de ori.
O altă aplicație, nu mai puțin semnificativă, a reconstrucției proteinelor, care este de importanță practică, este modificarea subtilizinei Bacillus amyloliquefaciens, dezvoltată de Estell și autori. Subtilizinele sunt serin proteinaze care sunt secretate de bacili în mediul extern. Aceste enzime sunt produse de industria biotehnologică pe scară largă și sunt utilizate pe scară largă în diverse industrii. Există puține subtilizine și există o scădere bruscă a activității proteolitice în prezența agenților de oxidare, inclusiv a pulberilor. Reconstrucția moleculei de subtilizină BPN a avut ca scop stabilizarea acesteia înainte de oxidarea chimică.
Experimentele timpurii au arătat că, în prezența peroxidului de apă, subtilizina reduce ușor activitatea datorită oxidării excesului de metionină-222, care este transformată în hidrogen sulfoxid. Folosind metode de mutageneză specifice locului, a fost posibilă înlocuirea acestui exces de metionină cu 19 aminoacizi proteici. Plasmidele cu gene mutante au fost introduse în tulpini cu deleții în gene similare și a fost analizată puterea subtilizinelor care au fost produse. Mutanții care conțin serină și alanină222 s-au dovedit a fi destul de stabili la peroxidul de hidrogen. S-a descoperit că cel mai activ mutant răzbună excesul de cisteină-222, a cărui activitate a fost cu 38% mai mare decât cea a tulpinii de tip sălbatic.
O metodă similară a fost utilizată pentru a promova activitatea interferonului b. Printre alte realizări ale ingineriei proteinelor poate fi numită investigarea activității de transformare a oncoproteinelor; modificarea termostabilității enzimelor, de exemplu, îndepărtarea reninei termolabile și a a-amilazei termostabile; Creșterea eficienței legării insulinei la receptorul membranei plasmatice prin înlocuirea histidinei cu aspartat în hormonul 10 b-lanzyug, precum și fără alte aplicații. Multe produse ale ingineriei proteinelor și-au găsit deja o utilizare practică în procesele de producție.
Lucrări de curs
de la disciplina: Silsky Podar biotehnologie
pe tema: „Ingineria proteinelor”
Intrare Ingineria proteinelor
1 Concepte de inginerie a proteinelor. Istoricul dezvoltării
2 Strategii de inginerie a proteinelor. Aplicarea proteinelor artificiale. Starea ingineriei proteinelor
1 Biblioteci de peptide și epitopi
2 Proteine reporter în proteine hibride
3 Acțiuni pentru realizarea inginerii proteinelor.
Visnovok
Lista de referinte
Eseu
Tema lucrării: Ingineria proteinelor.
Cuvinte cheie: biotehnologie, inginerie genetică, proteină, cod genetic, genă, ADN, ARN, ATP, peptide, epitop.
Meta, desigur, lucru: învățarea conceptului de „ingineria proteinelor” și capabilitățile potențiale și vikoriztaniya.
Potențialul ingineriei proteinelor:
Schimbând importanța legării substanței care se transformă, substratul, la enzimă, este posibilă promovarea eficienței catalitice a reacției enzimatice.
Prin creșterea stabilității proteinei pe o gamă largă de temperaturi și a acidității mijlocii, aceasta poate fi determinată în soluția în care proteina de ieșire se denaturează și își pierde activitatea.
După ce au creat proteine care funcționează în agenți anhidri, este posibilă promovarea reacțiilor catalitice în mințile nefiziologice.
Prin schimbarea centrului catalitic al unei enzime, puteți crește specificitatea acesteia și puteți reduce numărul de reacții secundare inutile.
Prin creșterea stabilității proteinei la enzimele care o descompun, puteți simplifica procedura de purificare.
Prin înlocuirea proteinei în așa fel încât să poată funcționa fără componenta esențială a aminoacizilor (vitamina, atom de metal etc.), o poți folosi în multe procese tehnologice continue.
Prin modificarea structurii secțiunilor de reglare ale enzimei, este posibil să se schimbe stadiul galvanizării acesteia cu produsul reacției enzimatice la reacția de contagiune negativă și, prin urmare, să se mărească randamentul produsului.
Este posibil să se creeze o proteină hibridă care are funcțiile a două sau mai multe proteine.
Puteți crea o proteină hibridă, una dintre parcelele căreia este ușurată din proteina hibridă din celula care este cultivată sau obținută din sumă.
introduce
De multă vreme, biotehnologia a fost importantă în industria alimentară și ușoară: în vinificație, produse de panificație, produse lactate fermentate, în prelucrarea inului și a pieilor pe bază de microorganisme congelate Schimbare. În ultimul deceniu, capacitățile biotehnologiei s-au extins enorm. Acest lucru se datorează faptului că metodele lor sunt importante din simplul motiv că la organismele vii reacțiile biochimice, care sunt catalizate de enzime, depășesc intervalul optim (temperatură și viciu), mai productive, ecologice și nu conțin reactivi chimici. , Ce să rupă din mijloc.
Obiectele biotehnologiei includ numeroși reprezentanți ai grupurilor de organisme vii - microorganisme (viruși, bacterii, protozoare, ciuperci de drojdie), plante, creaturi și celule izolate și componente subcelulare (organele) și enzime ale acestora. Biotehnologia se bazează pe procese fiziologice și biochimice care au loc în sistemele vii, care au ca rezultat energia vizibilă, sinteza și descompunerea produselor metabolice, formarea componentelor chimice și structurale la litini.
Obiectivul principal al biotehnologiei este producerea de microorganisme suplimentare și celule eucariote cultivate, compuși biologic activi (enzime, vitamine, hormoni), medicamente (antibiotice, vaccinuri, siropuri, anticorpi foarte specifici etc.), precum și compuși valoroși (furaje). aditivi, aminoacizi, proteine furajere etc.).
Metodele de inginerie genetică au făcut posibilă sintetizarea la animalele industriale a unor hormoni precum insulina și somatotropina (hormonul de creștere), care sunt necesari pentru tratamentul bolilor genetice la om.
Biotehnologia depinde nu numai de știința și producția specifică. Există o sarcină metodologică globală mai mare - extinde și accelerează amploarea afluxului de oameni în natura vie și aduce adaptarea sistemelor vii la mintea oamenilor vii, apoi la noosferă. Biotehnologia, în acest fel, acționează ca un agent activ al evoluției adaptative antropice.
Biotehnologia, ingineria genetică și ingineria celulară au perspective promițătoare. Odată cu apariția de noi și noi vectori, oamenii cu ajutorul lor în promovarea genelor necesare în cultura plantelor, animalelor și oamenilor. Acest lucru va permite oamenilor să se recupereze treptat după o varietate de boli, să amestece țesuturi și să sintetizeze proteine esențiale și substanțe biologic active și apoi - proteine și aminoacizi esențiali care sunt încorporați în I live. Folosind metode vicoristice, deja stăpânite de natură, biotehnologii încep să recupereze apa pentru fotosinteză suplimentară - apă de ardere ecologică, electricitate și să transforme azotul atmosferic în amoniac pentru minți extraordinare.
Puterile fizice și chimice ale proteinelor naturale nu satisfac adesea mințile în care aceste proteine vor fi indirecte pentru oameni. Este necesară modificarea structurii sale primare pentru a asigura formarea proteinei cu o structură anterioară diferită, inferioară și noi proprietăți fizice și chimice, care permit, în alte minți, să piardă puterea funcțiilor naturale ale proteinelor. Ingineria proteinelor se ocupă cu proiectarea proteinelor.
Un alt domeniu al ingineriei proteinelor este crearea de proteine care pot neutraliza substanțe și microorganisme care pot fi folosite ca surse pentru atacuri chimice și biologice. De exemplu, enzimele hidrolaze sunt produse pentru a mesteca atât gazele nervoase, cât și pesticidele care sunt folosite în regatul agricol. În acest caz, producerea, conservarea și producerea de enzime nu este nesigură pentru mediul și sănătatea oamenilor.
Pentru izolarea proteinei modificate se folosesc metode de chimie combinatorie și se folosește mutageneza directă - introducând modificări specifice secvenței de codificare a ADN-ului, ceea ce duce la modificări specifice ale secvențelor de aminoacizi. Pentru proiectarea eficientă a unei proteine pe baza proprietăților date, este necesar să se cunoască modelele de formare a structurii spațiale a proteinei, care stau la baza proprietăților și funcțiilor sale fizice și chimice, deci este necesar să se cunoască care este principalul On. structura proteinei, surplusul său de aminoacizi se varsă în puterea și funcția proteinei. Din păcate, majoritatea proteinelor au o structură terțiară necunoscută, care va deveni în curând clară, atât aminoacidul în sine, cât și secvența de aminoacizi trebuie schimbate pentru a extrage proteina cu puterea necesară. În zilele noastre, cu ajutorul analizei computerizate, este posibil să se prezică nivelurile de proteine bogate pe baza secvenței exceselor lor de aminoacizi. O astfel de analiză va simplifica procedura de creare a proteinelor necesare. Deocamdată, pentru a elimina modificările proteinelor cu puterea necesară, este important să luăm o altă cale: să eliminăm o serie de gene mutante și să găsim produsul proteic al uneia dintre ele, care are puterea necesară.
Pentru mutageneza directă, sunt utilizate diferite abordări experimentale. După eliminarea modificărilor din genă, aceasta este generată din constructul genetic și introdusă în celulele procariote sau eucariote pentru a promova sinteza proteinei codificate de constructul genetic.
I. Ingineria proteinelor
1 Concepte de inginerie a proteinelor. Istoricul dezvoltării
Ingineria proteinelor este o ramură a biotehnologiei care se ocupă cu dezvoltarea proteinelor și a proteinelor valoroase. Aceasta este o disciplină complet nouă, care are ca scop studierea plierii proteinelor și a principiilor de modificare și compoziție a proteinelor.
Există două strategii principale pentru ingineria proteinelor: modificarea directă a proteinei și evoluția directă. Aceste metode se exclud reciproc; Pre-detectivei devin adesea jigniți. O cunoaștere mai detaliată a structurii și funcției proteinelor, precum și progresele în tehnologie de înaltă tehnologie, pot extinde semnificativ capacitățile ingineriei proteinelor. Ca rezultat, aminoacizii nenaturali pot fi incluși într-o nouă metodă care permite includerea de noi aminoacizi în codul genetic.
Ingineria proteinelor provine din fizica proteinelor, chimia proteinelor și ingineria genetică. Aceasta implică crearea de molecule de proteine modificate și hibride cu caracteristici specificate. Modul natural de implementare a unei astfel de sarcini este de a transfera structura genei care codifică modificările proteinelor, îmbunătățind sinteza, clonarea și expresia acesteia în celulele primitoare.
Prima modificare controlată a proteinei a fost efectuată la mijlocul anilor '60 de către Koshland și Bender. Pentru a înlocui gruparea hidroxil cu o grupare sulfhidril în centrul activ al proteazei, subtilizină, a fost utilizată o metodă de modificare chimică. Cu toate acestea, după cum a fost clar, o astfel de tiolsubtilizină nu păstrează activitatea proteazei.
O proteină preparată chimic are același tip de moleculă, cum ar fi un compus poliaminoacid sau un polimer. Compus din secvențe de aminoacizi de 20 de tipuri. După ce au recunoscut natura proteinelor, oamenii au întrebat: cum putem proiecta secvențe de aminoacizi complet noi, astfel încât acestea să poată îndeplini funcțiile umane necesare mai eficient decât proteinele originale? Această idee se numește Ingineria proteinelor.
Oamenii au început să vorbească despre o astfel de inginerie încă din anii 50 ai secolului XX. Acest lucru s-a întâmplat imediat după descifrarea primelor secvențe de aminoacizi proteici. Numeroase laboratoare din întreaga lume au început să lucreze la duplicarea naturii și sintetizarea chimică cu secvențe de poliaminoacizi absolut suficiente.
Cel mai mare contributor la acest succes este chimistul B. Merrifield. Astfel, americanii au reușit să dezvolte o metodă extrem de eficientă pentru sinteza lancelor de poliaminoacizi. Merrifield a primit Premiul Nobel pentru Chimie în 1984.
Malyunok 1. Schema de funcționare a ingineriei proteinelor
Americanul a început să sintetizeze peptide scurte, inclusiv hormoni. Cu aceasta, fiind o mașină automată - un „robot chimic” - a cărei sarcină era să vibreze proteinele individuale. Robotul a creat senzație în miza științei. Cu toate acestea, era clar că produsele sale nu pot concura cu ceea ce natura evoluează.
Robotul nu a putut crea cu acuratețe secvențe de aminoacizi, așa că ar avea milă. Sintetizăm o lance cu o secvență și o schimbăm pe cealaltă în doar câteva minute. Într-o celulă, toate moleculele unei proteine sunt perfect similare între ele, deci secvențele lor sunt absolut aceleași.
A mai fost o problemă. Cu toate acestea, acele molecule pe care robotul le-a sintetizat corect nu au dobândit aceeași formă spațială care este necesară pentru funcționarea enzimei. Astfel, încercarea de a submina natura folosind cele mai avansate metode ale chimiei organice a avut un succes modest.
A fost imposibil ca natura să înceapă să dezvolte modificările necesare ale proteinelor. Aici, în natură, apar întotdeauna mutații care duc la modificări ale secvențelor de aminoacizi ale proteinelor. Dacă selectați mutanți cu puterile necesare care sunt mai eficienți în conversia unui alt substrat, atunci puteți vedea de la un astfel de mutant o enzimă care produce noi puteri. Acest proces durează destul de mult.
Totul s-a schimbat când ingineria genetică a luat stăpânire. Au început să creeze gene unice din orice secvență de nucleotide. Aceste gene au fost folosite la prepararea moleculelor vectori și acest ADN a fost produs în bacterii și drojdii. Acolo, o copie a ARN a fost luată de la o genă unică. Ca urmare, s-a pierdut proteina necesară. Beneficiile sintezei mele au fost oprite. Golovnya, a fost necesar să se selecteze secvența ADN necesară, iar apoi sistemul enzimatic al celulei în sine a lucrat inconștient pe cont propriu. În acest fel, este posibil să se dezvolte ideea că ingineria genetică a extins calea ingineriei proteinelor în forma sa cea mai radicală.
1.2 Strategii de inginerie a proteinelor
Modificarea directă a proteinei. La modificarea directă a unei proteine, este necesară o cunoaștere detaliată a structurii și funcției proteinei pentru a face modificările necesare. De regulă, această metodă are avantajul de a fi ieftină și dificilă din punct de vedere tehnic, deoarece tehnica mutagenezei direcționate este bine stabilită. Cu toate acestea, principalul său dezavantaj este că informațiile despre structura raportată a unei proteine sunt adesea limitate și, dacă structura este cunoscută, poate fi important să se transmită influxul diferitelor mutații.
Algoritmii software pentru modificarea proteinelor sunt proiectați pentru a identifica noi secvențe de aminoacizi care necesită puțină energie pentru a forma o nouă structură țintă. Deoarece secvența care poate fi găsită este mare, cea mai mare oportunitate de modificare a proteinei este o modalitate rapidă și precisă de a identifica și determina secvența optimă la schimbarea acesteia.secvențe suboptimale similare.
Evoluția a fost îndreptată. În evoluția directă, mutageneza suficientă este concentrată asupra proteinei și selecția este efectuată pentru a selecta variantele care sunt susceptibile de a cânta. Runde ulterioare de mutație și selecție vor continua. Această metodă are o evoluție naturală și vă permite să obțineți rezultate miraculoase pentru modificarea directă.
O metodă suplimentară, cunoscută sub numele de amestecarea ADN-ului, amestecă și dezvăluie părți din diferite variante pentru a elimina cele mai scurte rezultate. Acest proces implică recombinare, care are loc în mod natural în timpul reproducerii statistice. Avantajul evoluției directe este că nu necesită cunoștințe avansate despre structura proteinei și nu este necesar să se prezică ce tip de mutație va apărea. De fapt, rezultatele experimentelor în evoluție directă arată că fragmentele de fructe se modifică deseori duc la mutații, care nu sunt de vină pentru un astfel de efect. Cu toate acestea, această metodă realizează un randament ridicat, ceea ce nu este posibil pentru toate proteinele. O cantitate mare de ADN recombinat este probabil să fie mutată și este necesar să se verifice produsele pentru defecte. Numărul mare de opțiuni necesită adesea achiziționarea de robotică pentru a automatiza procesul. În plus, nu este niciodată ușor să verificați orice defecte.
II. Aplicații ale proteinelor modificate
Ingineria proteinelor se poate baza pe modificarea chimică a proteinei finite sau pe metode de inginerie genetică care fac posibilă izolarea variantelor modificate ale proteinelor naturale.
Proiectarea unui catalizator biologic se bazează pe specificul proteinei și pe activitatea catalitică a complexului metal-organic. Axa de aplicare a unor astfel de modificări a fost efectuată pentru a elimina complecși bioorganici sintetici. Mioglobina produsă de cașalot leagă acidul, dar nu are activitate biocatalitică. Ca rezultat al combinației de biomolecule cu trei complecși de transfer de electroni care elimină ruteniul, care este asociat cu excesul de histidină pe suprafața moleculelor de proteine, se creează un complex care creează aciditate peste noapte o serie de substraturi organice oxidate, cum ar fi ascorbatul, datorită unui astfel de g, ca pentru ascorbat oxidază naturală. În principiu, proteinele pot fi modificate în alte moduri. Să aruncăm o privire, de exemplu, Papain. Este necesar să se dezvolte enzime proteolitice bune, pentru care este indicată o structură banală. În apropierea excesului de cisteină-25, pe suprafața moleculei proteice se dezvoltă un șanț lung, în care are loc reacția de proteoliză. Acest plot poate fi alchilat cu flavine similare fără a modifica disponibilitatea plotului pentru a lega substraturile potențiale. Astfel de flavopapine modificate au fost utilizate pentru oxidarea M-alchil-1,4-dihidronicotinamidelor, iar activitatea catalitică a unora dintre aceste proteine modificate a fost similară cu cea a proteinelor naturale.flavoprotein-NADH-dehidrogenază. Această metodă a reușit să creeze o enzimă sintetică foarte eficientă. Combinația de flavine foarte active, care se găsesc în agenții lor de extracție de electroni, poate permite dezvoltarea catalizatorilor eficienți pentru îmbunătățirea amidei nicotinei.
Marile succese obținute recent în sinteza chimică a ADN-ului au deschis noi posibilități pentru ingineria proteinelor: proiectarea de proteine unice care nu converg în natură. Pentru care este necesară și dezvoltarea ulterioară a tehnologiei, astfel încât schimbarea genelor prin metode de inginerie genetică să conducă la transferul modificărilor proteice, la îmbunătățirea unei game întregi de caracteristici funcționale: număr de rotații, km pentru un anumit substrat, termostabilitate, temperatura optimă, stabilitate și activitate în agenți neapoși, specificitatea substratului și a reacției, necesarul de cofactori, pH-ul optim, rezistența la proteaze, reglarea alosterică, greutatea moleculară și conținutul de subunități. Pentru a obține această creștere, a fost posibil să se realizeze acest lucru prin mutageneză și selecție suplimentară și, în final, prin modificare chimică și imobilizare. Pentru a proiecta cu succes un anumit tip de moleculă de proteine, este necesar să se identifice o serie de modele de bază care relaționează caracteristicile structurale ale proteinelor și bazele lor de putere. Astfel, cunoscând structura cristalină exactă a moleculei de proteină care este procesată, este posibil să se identifice acele secțiuni care pot fi modificate direct pentru a spori activitatea sa catalitică. O astfel de modificare poate implica o schimbare a secvenței de aminoacizi a proteinei.
O altă metodă poate fi mutageneza locului specific. Vinul este preparat în acest fel. Clonează gena proteinei care va fi reprodusă în descendent și reproduce-o într-un purtător genetic similar. Apoi sintetizați un primer oligonucleotidic cu o singură mutație, a cărei secvență este de zece până la cincisprezece nucleotide este suficient omoloagă cu o singură diviziune a genei naturale și astfel creează o structură hibridă cu aceasta. Acest primer sintetic este convertit în polimeraze pentru a iniția sinteza unei copii complementare a vectorului, care este apoi adăugată la original și convertită la sinteza controlată a proteinei mutante. O abordare alternativă a bazelor pe lancea despicată, îndepărtată la locul care promovează schimbările și înlocuită cu un analog sintetic cu secvența de nucleotide necesară.
Tirosil-ARNt sintetaza catalizează reacția de aminoacilare a ARNt de tirozină, care implică activarea tirozinei cu ajutorul ATP și adenilat de tirozin. Gena acestei enzime a fost observată în Bacillus stearothermophilus și a fost observată în bacteriofagul M13. Apoi puterea catalitică a enzimei, în special capacitatea sa de a lega substratul, a fost modificată prin modificarea specifică locului. Astfel, treonina-51 a fost înlocuită cu alanină. Acest lucru a condus la o creștere a legării de substrat, posibil datorită incapacității de a forma o legare a apei între acest exces și adenilat de tirozil. La înlocuirea alaninei cu prolină, configurația moleculei enzimei este perturbată, dar capacitatea de a se lega de substrat crește de o sută de ori, deoarece interacțiunea sa cu histidina-48 devine mai ușoară. Astfel de modificări specifice locului au fost îndepărtate din p-lactamază și, prin urmare, au fost însoțite de inactivarea enzimei. Înlocuirea serinei-70 cu cisteină duce la formarea p-tiolactamazei, a cărei constantă de legare nu diferă de cea a enzimei naturale, dar activitatea în raport cu penicilina devine mai mică de 1-2%. Activitatea acestei enzime mutante împotriva cefalosporinelor active nu este mai mică decât activitatea cobului, sau mai degrabă o depășește; Aceste proteine sunt, de asemenea, rezistente la proteaze.
Mutațiile care sunt asociate cu afluxul specific locului sunt folosite astăzi pentru a verifica caracterul adecvat al rezultatelor studiilor structurale. În unele cazuri, a fost posibil să se arate că stabilitatea structurală a proteinei și activitatea sa catalitică pot fi perturbate. S-a acumulat o cantitate suficientă de informații despre interacțiunile dintre stabilitatea structurii proteinei și funcția acesteia, ceea ce poate contribui la reglarea fină a activității catalizatorilor biologici și poate crea analogi complet sintetici. Recent a apărut un studiu care a raportat clonarea primei gene sintetice pentru enzima care codifică fragmentul activ al moleculei de ribonuclează.
III. Starea ingineriei proteinelor
Una dintre cele mai populare domenii ale ingineriei proteinelor este schimbarea puterilor catalitice ale enzimelor în dezvoltarea proceselor industriale „prietenoase cu mediul”. Din punctul de vedere al protecției mediului în exces, enzimele sunt cei mai potriviti dintre toți catalizatorii din industrie. Acest lucru asigură că biocatalizatorii pornesc în apă și funcționează pe deplin într-un mediu cu pH neutru și la temperaturi relativ scăzute. În plus, în ciuda specificității lor ridicate, ca urmare a stagnării biocatalizatorilor, se creează foarte puține produse secundare inutile. Procesele industriale prietenoase cu mediul și economisind energie care utilizează biocatalizatori au fost de mult timp comercializate în mod activ în industria chimică, textilă, farmaceutică, celuloză, grub, energie și alte domenii ale industriei actuale.
Cu toate acestea, caracteristicile biocatalizatorilor sunt nedorite într-un număr de cazuri. De exemplu, majoritatea enzimelor se dezintegrează odată cu creșterea temperaturii. Există acum o încercare de a corecta astfel de defecte și de a crește stabilitatea enzimelor în mințile cele mai inovatoare folosind metode de inginerie a proteinelor.
Pe lângă stagnarea industrială, ingineria proteinelor și-a găsit locul în cercetarea medicală. Descendenții sintetizează proteine care se leagă de viruși și gene mutante care produc puf și le zeshkozhuvat; Sunt create vaccinuri extrem de eficiente și implică proteine receptor de pe suprafața celulei, care sunt adesea ținte pentru produsele farmaceutice. Anterior, cei care sunt implicați în dezvoltarea produselor alimentare, folosesc ingineria proteinelor pentru a reduce conținutul de proteine, ceea ce asigură conservarea produselor vegetale, precum și a substanțelor gelatinoase și a gustărilor.
Un alt domeniu al ingineriei proteinelor este crearea de proteine care pot neutraliza substanțe și microorganisme care pot fi folosite ca surse pentru atacuri chimice și biologice. De exemplu, enzimele hidrolaze sunt produse pentru a mesteca atât gazele nervoase, cât și pesticidele care sunt folosite în regatul agricol. În acest caz, producerea, conservarea și producerea de enzime nu este nesigură pentru mediul și sănătatea oamenilor.
3.1 Biblioteci de peptide și epitopi
Într-un organism viu, majoritatea proceselor biologice sunt controlate prin interacțiuni specifice proteină-proteină sau proteină-acid nucleic. Astfel de procese includ, de exemplu, reglarea transcripției genelor sub influența diverșilor factori proteici, interacțiunea liganzilor proteici cu receptorii de pe suprafața celulelor, precum și legarea specifică a antigenului și anticorpii înrudiți. Înțelegerea mecanismelor moleculare de interacțiune între liganzii proteici și receptori este de o mare importanță fundamentală și aplicată. Zokrema, dezvoltarea de noi medicamente de natură proteică începe cu identificarea secvenței de ieșire a aminoacizilor care au activitatea biologică necesară (așa-numitul „plumb” pos. Iceness). Cu toate acestea, peptidele cu secvența principală de aminoacizi pot avea efecte biologice nejustificate: activitate scăzută, toxicitate, stabilitate scăzută în organism etc.
Înainte de apariția bibliotecilor de peptide, dezvoltarea autorităților lor biologice s-a realizat prin sinteza secvențială a unui număr mare de analogi și verificarea activității lor biologice, ceea ce a necesitat o mare investiție de timp și bani. În cele din urmă, a fost posibilă utilizarea sintetizatoarelor automate pentru a crea mii de peptide diferite într-un timp scurt. Metodele avansate de mutageneză directă au făcut posibilă, de asemenea, extinderea dramatică a numărului de proteine care pot fi captate la un moment dat și testate în mod constant pentru activitatea biologică. Cu toate acestea, abordările recente ale creării bibliotecilor de peptide au condus la identificarea a milioane de secvențe de aminoacizi necesare pentru screening-ul eficient pentru a identifica peptidele mijlocii care asigură satisfacția maximă.criterii care sunt suspendate. Astfel de biblioteci sunt în curs de dezvoltare pentru a monitoriza interacțiunea anticorpilor cu antigenele, pentru a identifica noi inhibitori de enzime și agenți antimicrobieni, pentru a proiecta molecule care pot avea activitatea biologică necesară sau pentru a oferi noi puteri pentru proteine, cum ar fi anticorpii.
Pe baza metodelor de achiziție, bibliotecile de peptide sunt împărțite în trei grupuri. Primul grup poate include biblioteci derivate din sinteza chimică a peptidelor, în care peptidele individuale sunt imobilizate pe micronoze. Cu această abordare, după adăugarea aminoacizilor de vierme în amestecuri de reacție individuale la peptidele imobilizate pe micronoze, în loc de toate amestecurile de reacție, se combină și sub Utilizare în porții noi, care sunt utilizate în stadiul incipient al ingerării de noi surplusuri de aminoacizi. După efectuarea unor niveluri scăzute ale unor astfel de etape, peptidele sunt sintetizate, ceea ce înlocuiește secvența deficiențelor în sinteza aminoacizilor în diferite tipuri de compuși.
Bibliotecile de peptide imobilizate pe micronoze sunt insuficiente: ele pot fi văzute la screeningul receptorilor purificați vicoristici care sunt într-o formă minoră. În același timp, în majoritatea cazurilor în testele biologice, care sunt efectuate pentru studii fundamentale și farmacologice, se constată cel mai adesea că receptorii asociați cu membranele stagnează. Alternativ, bibliotecile de peptide pot fi separate folosind sinteza de peptide în fază solidă, care implică adăugarea chimică a aminoacizilor de vierme la proteinele peptidice în stadiul pielii, permițându-le să crească și să se formeze în cantități echimolare și toți sau oricare dintre aminoacizii precursori. În etapa finală a sintezei, peptidele sunt întărite din nas, apoi. tradus în formă obișnuită. A treia abordare a construcției de biblioteci de peptide, pe care acum trecem să o descriem, a devenit o dezvoltare reală a metodelor de inginerie genetică. Vine ilustrează în mod miraculos fezabilitatea unor astfel de metode și, fără îndoială, marile realizări pe care le-au obținut. În legătură cu aceasta, vom analiza rezultatele raportate ale studiului bibliotecilor de peptide în epitopii (determinanți antigenici) studiati ai proteinelor.
Tehnologia de inginerie genetică pentru îndepărtarea proteinelor hibride a făcut posibilă dezvoltarea unei metode eficiente de preparare a peptidelor scurte pentru analiza activității lor biologice. Pe lângă un număr mare de biblioteci de gene, biblioteci de peptide, selectate prin metode de inginerie genetică și un set mare (adesea exhaustiv) de peptide scurte. Două abordări dezvoltate recent fac posibilă vizualizarea unei biblioteci de peptide simultan ca o bibliotecă de epitopi de proteine. În primul rând, peptidele scurte pot include toți excesul de aminoacizi majori care joacă un rol major în interacțiunea cu anticorpii și pot avea mari determinanți antigenici ai proteinelor. Cu alte cuvinte, în majoritatea cazurilor există legături necovalente care se creează între cele mai importante surplusuri de aminoacizi ai liganzilor proteici și receptorii acestora, reducând principalele contribuții ale energiei de aprindere în interacțiunea reciprocă ii ligand-receptor. Privind-o, orice peptidă poate fi văzută ca un potențial ligand, o haptenă sau o parte a determinantului antigenic al polipeptidelor mari, iar o bibliotecă de peptide poate fi văzută ca o bibliotecă de epitopi de proteine sau potențiale proteine. .
Biblioteca de peptide, distilată ca urmare a implementării celei de-a treia abordări, pare în prezent a fi o colecție de zeci sau sute de milioane de secvențe scurte care variază, aminoacizi, cum ar fi expres, localizați pe suprafața virionilor bacteriofagi în apropierea depozitului. a proteinelor structurale ale umezelii. Acum este posibil să se introducă gene recombinante hibride în genomul bacteriofagelor folosind metode de inginerie genetică pentru a codifica modificări ale proteinelor structurale ale virionilor lor. (Această metodă se numește afișare fagică.) Ca rezultat al exprimării unor astfel de gene, sunt create proteine hibride, la capetele N sau C ale cărora sunt prezente secvențe suplimentare de aminoacizi.
Bibliotecile de peptide și epitopi își vor găsi acumularea în investigarea mecanismelor sistemului imunitar umoral, precum și a bolii sistemului imunitar. Zokrem, majoritatea bolilor autoimune sunt însoțite de dezvoltarea de autoanticorpi împotriva antigenelor din organism. Acești anticorpi sunt în multe cazuri markeri specifici ai altor boli autoimune. În principiu, este posibil să se identifice markeri peptidici dintr-o bibliotecă diversă de epitopi, în plus față de care ar fi posibilă monitorizarea specificității autoanticorpilor în timpul dezvoltării unui proces patologic atât într-un organism individual, cât și în grupuri de pacienți și, în plus, determinați specificitatea autoanticorpilor în cazurile de boală cu etiologie necunoscută.
Bibliotecile de peptide și epitopi pot fi, potențial, utilizate și pentru screeningul serurilor imune prin identificarea peptidelor care interacționează în mod specific cu anticorpii chimici. Astfel de peptide au determinanți antigenici împotriva organismelor patogene și servesc ca ținte pentru anticorpii chimici din organism. Este posibil să se utilizeze peptide similare pentru vaccinarea pacienților, care nu produc anticorpi împotriva agenților patogeni similari. Studiul epitopilor cu ajutorul bibliotecilor de peptide este completat de apariția uneia dintre numeroasele lor direcții în cercetarea aplicată și fundamentală privind interacțiunea liganzilor și receptorilor. O rafinare suplimentară a acestei abordări poate duce la dezvoltarea de noi medicamente bazate pe peptide scurte și bazate pe cercetarea fundamentală a mecanismelor interacțiunilor proteină-proteină.
3.2 Proteine reporter în proteine hibride
În alte cazuri, proteinele hibride sunt folosite pentru a obține un nivel ridicat de expresie a peptidelor scurte în celulele bacteriene datorită stabilizării acestor peptide în depozitarea proteinelor hibride. Proteinele hibride sunt adesea folosite pentru a identifica și purifica proteine recombinante importante. De exemplu, după ce a atins capătul C-terminal al proteinei urmărite ca proteină reporter galactozidază, este posibil să se purifice proteina recombinată pentru activitatea galactozidazei, ceea ce înseamnă determinanți antigenici prin metode imunochimice. Prin combinarea fragmentelor de ADN care combină cadrele de citire deschise (ORF) cu gene ale proteinei reporter, este posibilă purificarea unor astfel de proteine hibride pentru activitatea proteinei reporter și a le ținti pentru imunizare, creaturi de laborator. Anticorpii au fost îndepărtați și lăsați să stea pentru purificarea proteinei native, care conține polipeptida recombinantă codificată de ORF, și apoi fragmentul de genă donat este identificat.
Cu ajutorul proteinelor hibride, sarcina de a clona o genă necunoscută este rezolvată în produsul proteic al cărui anticorp este. În acest caz, este construită o bibliotecă de secvențe de nucleotide, care reprezintă ORF-ul genelor necunoscute, în vectori care permit conectarea ORF-ului care este donat în același cadru de citire ca și gena raportor. Proteinele hibride care sunt create ca urmare a exprimării acestor gene recombinante sunt identificate cu anticorpi suplimentari prin metode imunosorbente legate de enzime. Gbridni Geni, secretarul Shodnoye Bilki I Bilki-Rapoarte, da un nou doslіjuvati mecanizat la mâna a doua, și o astfel de lăcustă mă mișc în țesături Bilkiv, ShO Secret.
3.3 Amplea ingineriei proteinelor
Prin înlocuirea unui număr mare de excese de aminoacizi cu lizozima bacteriofagului T4 cu cisteină a fost îndepărtată o enzimă cu un număr mare de legături disulfurice, motiv pentru care această enzimă și-a păstrat activitatea la o temperatură mai ridicată.
Zamyna Zalishka cisteină pe Zalushka Serina în molecula r-Interferon Lyni, sinteza este sintetizată cu o paletă cu o paletă, iar eliminarea miracolelor complexelor moleculare, iar șurubul activ al șurubului zyago lіkarsky a fost vizitat de 10 ori.
Înlocuirea treoninei în exces cu un exces de prolină în molecula enzimei tirozil-ARNt sintetaza a promovat activitatea catalitică a acestei enzime de zeci de ori: a început să adauge rapid tirozină la ARNt, care transferă acest aminoacid în ribozom în timpul translației ii.
Subtilizinele sunt enzime bogate în serină care descompun proteinele. Duhoarea este secretată de un număr mare de bacterii și este abuzată pe scară largă de oameni pentru biodegradare. Este important să legați atomii de calciu pentru a le spori stabilitatea. Cu toate acestea, în procesele industriale există reacții chimice care leagă calciul, după care subtilizinele își pierd activitatea. După ce au schimbat gena, acum au eliminat aminoacizii din enzimă care participă la legarea calciului și au înlocuit un aminoacid cu altul prin creșterea stabilității subtilizinei. S-a constatat că enzima modificată este stabilă și activă funcțional în mințile apropiate industriei.
A fost demonstrată capacitatea de a crea o enzimă care funcționează ca o enzimă de restricție, care descompune ADN-ul în locuri strict desemnate. Ei au creat o proteină hibridă, dintre care un fragment a recunoscut secvența surplusurilor de nucleotide din molecula de ADN, iar celălalt a divizat ADN-ul aceluiași fragment.
Activatorul de plasminogen tisular este o enzimă utilizată clinic pentru a descompune cheaguri de sânge. Din păcate, se elimină rapid din sistemul de circulație sanguină și trebuie readministrată sau în doze mari, ceea ce poate duce la reacții adverse. Prin introducerea a trei mutații directe în gena acestei enzime, am eliminat enzima cu viață lungă, care are sporiditate avansată la fibrină, ceea ce are ca rezultat aceeași activitate fibrinolitică ca și enzima de ieșire.
După ce a înlocuit un aminoacid din molecula de insulină, acum a fost posibil să se obțină efectul ca atunci când acest hormon a fost administrat subcutanat celor care sufereau de diabet, concentrația acestui hormon în sânge a fost modificată aproape de cea fiziologică care apare după masă. .
Există trei clase de interferoni, care au activitate antivirală și anticanceroasă, dar prezintă specificitate diferită. Ar fi tentant să creăm un interferon hibrid care să aibă puterea a trei tipuri de interferoni. Au fost create gene hibride care au inclus fragmente de gene de interferon natural de mai multe tipuri. Unele dintre aceste gene, fiind absorbite în celulele bacteriene, au asigurat sinteza interferonilor hibrizi cu activitate anticanceroasă mai mare, mai mică decât cea a moleculelor lui Father.
Hormonul natural de creștere la om se leagă nu numai de receptorul acestui hormon, ci și de receptorul unui alt hormon - prolactina. Pentru a evita efectele secundare inutile în timpul procesului de tratament, s-a considerat posibil să se adauge hormon de creștere la receptorul de prolactină. Au realizat acest lucru prin înlocuirea mai multor aminoacizi din structura primară a hormonului de creștere cu ajutorul ingineriei genetice.
Agenții de infecție anti-VIL au îndepărtat acum o proteină hibridă, dintre care un fragment asigură legarea specifică a acestei proteine la limfocitele infectate cu virusul, celălalt fragment pătrunde în proteina hibridă în celula deteriorată și un alt fragment perturbând sinteza proteinelor în celula deteriorată și moartea .
Proteinele sunt metoda principală în scopuri medicinale. Există aproximativ 500 de ținte pentru atac. În viitorul apropiat, numărul acestora va crește la 10.000, ceea ce va permite crearea unor sisteme noi, eficiente și sigure. În același timp, sunt dezvoltate abordări fundamental noi pentru căutarea proprietăților medicinale: țintele nu sunt proteine unice, ci complexele lor, interacțiunile proteină-proteină și plierea proteinelor.
Visnovok
Tehnologia de inginerie a proteinelor este folosită (deseori combinată cu ADN recombinant) pentru a spori puterile proteinelor naturale (enzime, anticorpi, receptori celulari) și pentru a crea noi proteine și ceea ce natura nu își poate imagina. Astfel de proteine sunt utilizate pentru crearea de preparate medicinale, în timpul procesării produselor cu grop și în producția industrială.
Una dintre cele mai populare domenii ale ingineriei proteinelor este schimbarea puterilor catalitice ale enzimelor în dezvoltarea proceselor industriale „prietenoase cu mediul”. Din punctul de vedere al protecției mediului în exces, enzimele sunt cei mai potriviti dintre toți catalizatorii din industrie. Acest lucru asigură că biocatalizatorii pornesc în apă și funcționează pe deplin într-un mediu cu pH neutru și la temperaturi relativ scăzute. În plus, în ciuda specificității lor ridicate, ca urmare a stagnării biocatalizatorilor, se creează foarte puține produse secundare inutile. Procesele industriale prietenoase cu mediul și economisind energie care utilizează biocatalizatori au fost de mult timp comercializate în mod activ în industria chimică, textilă, farmaceutică, celuloză, grub, energie și alte domenii ale industriei actuale.
Cu toate acestea, caracteristicile biocatalizatorilor sunt nedorite într-un număr de cazuri. De exemplu, majoritatea enzimelor se dezintegrează odată cu creșterea temperaturii. Există acum o încercare de a corecta astfel de defecte și de a crește stabilitatea enzimelor în mințile cele mai inovatoare folosind metode de inginerie a proteinelor.
Pe lângă stagnarea industrială, ingineria proteinelor și-a găsit locul în cercetarea medicală. Descendenții sintetizează proteine care se leagă de viruși și gene mutante care produc puf și le zeshkozhuvat; Sunt create vaccinuri extrem de eficiente și implică proteine receptor de pe suprafața celulei, care sunt adesea ținte pentru produsele farmaceutice. Anterior, cei care sunt implicați în dezvoltarea produselor alimentare, folosesc ingineria proteinelor pentru a reduce conținutul de proteine, ceea ce asigură conservarea produselor vegetale, precum și a substanțelor gelatinoase și a gustărilor.
Un alt domeniu al ingineriei proteinelor este crearea de proteine care pot neutraliza substanțe și microorganisme care pot fi folosite ca surse pentru atacuri chimice și biologice. De exemplu, enzimele hidrolaze sunt produse pentru a mesteca atât gazele nervoase, cât și pesticidele care sunt folosite în regatul agricol. În acest caz, producerea, conservarea și producerea de enzime nu este nesigură pentru mediul și sănătatea oamenilor.
mutageneza de inginerie a modificării proteinelor
Lista de referinte
1. Ingineria proteinelor.
2. Ingineria proteinelor. Misterele geneticii. / Vyacheslav Markin // Mistere, mistere, fapte.
Ingineria proteinelor. //Marea Enciclopedie Rusă.
Ingineria proteinelor. // Dovidnik khimika 21.
Ingineria proteinelor și eficiența proteinelor.
Ingineria proteinelor. / A.I. Kornelyuk//Biopolimeri și celule.
Ingineria proteinelor îmbunătățește eficacitatea proteinelor. // Mecanica populară.
Ingineria proteinelor. Obsesia pentru insulină. // Biofile este o revistă științifică și de informare.
Biotehnologie. Principalele direcții și ajunge. // Biologie pentru solicitanți și cititori.
Bogdanov A.A., Mednikov B.M. Vlada nad gene/A. A. Bogdanov, B.M. Mednikov - M.: Prosvitnitstvo, 1989 - p.208
Inginerie genetică. // Sănătos.
Geni și chimiști. // Genetica.
13. Glik B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Principii și zastosuvannya / B. Glik, J. Pasternak. - M: Svit, 2002.
14. Alte probleme ale ingineriei genetice. / L.V. Timoschenka, M.V. Chubik // Medicină - noi tehnologii.
15. Egorova T.A., Klunova S.M., Zhivukhin E.A. Fundamentele biotehnologiei. / T.A. Egorova, S.M. Klunova, E.A. Jivukhin - M., 2003.
16. Ingineria proteinelor. // Chimie și biotehnologie.
17. Patrushev L.I. Exprimarea genelor/L.I. Patrushev – M.: Nauka, 2000. – 496 p.
Patrushev L.I. Sisteme genetice ale piesei. T. 1: Ingineria genelor și proteinelor. / L.I. Patrushev – M.: Nauka, 2004. – 526 p.
Ribchin V.M. Fundamentele ingineriei genetice: Manual pentru universități/V.M. Ribchin - Sankt Petersburg: Vedere SPbDTU, 2002. - 522 p.
Stepanov V.M. Biologie moleculară Structurile și funcțiile proteinelor. / V.M. Stepanov - M.: Școala Vișcha, 1996.
Tehnologii biotehnologice: ingineria proteinelor, nanobiotehnologie, biosenzori și biocipuri. / Evgeniya Ryabtseva // „Biotehnologie comercială” - revistă online.
Chernavsky D.S., Chernavska N.M. Belok-mașină. Structuri macromoleculare biologice. / D.S. Chernavsky, N. M. Chernavska - M: Vedere a MDU, 1999.
Schultz G.E., Schirmer R.H. Principii de organizare structurală a proteinelor. / G.Da. Schultz, R.H. Schirmer - M.: Svit, 1982.
24. Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Ingineria proteinelor la 20 de ani // Nature Reviews. Biologie celulară moleculară. 2002. Vol. 3. Nr. 12;
25.Ingineria proteinelor. // Wikipedia, enciclopedie liberă.
După ce s-a luat în considerare modalități de a elimina mutațiile specifice locului, este necesar să se lucreze doar cu un pas pentru a ieși imediat din turbulența geneticii moleculare, numită inginerie proteică. De fapt, dezvoltarea metodelor de mutageneză directă a făcut posibilă, cu mare precizie, modificarea proteinelor și identificarea relațiilor lor structural-funcționale și construirea de noi proteine, ca în natură. Cele mai izbitoare rezultate ale acestei abordări sunt proteinele hibride bazate pe combinația de fragmente și domenii funcționale ale diferitelor proteine polipeptidice cu o varietate de metode de inginerie genetică.
O altă direcție promițătoare a ingineriei proteinelor este proiectarea peptidelor active biologic care au activitate farmacologică.
Biblioteci de peptide și epitopi
Într-un organism viu, majoritatea proceselor biologice sunt controlate prin interacțiuni specifice proteină-proteină sau proteină-acid nucleic. Astfel de procese includ, de exemplu, reglarea transcripției genelor sub influența diverșilor factori proteici, interacțiunea liganzilor proteici cu receptorii de pe suprafața celulelor, precum și legarea specifică a antigenului și anticorpii înrudiți. Înțelegerea mecanismelor moleculare de interacțiune între liganzii proteici și receptori este de o mare importanță fundamentală și aplicată. Zokrema, dezvoltarea de noi medicamente de natură proteică începe cu identificarea secvenței de ieșire a aminoacizilor care au activitatea biologică necesară (așa-numitul „plumb” pos. Iceness). Cu toate acestea, peptidele cu secvența principală de aminoacizi pot avea efecte biologice nejustificate: activitate scăzută, toxicitate, stabilitate scăzută în organism etc.
Înainte de apariția bibliotecilor de peptide, dezvoltarea autorităților lor biologice s-a realizat prin sinteza secvențială a unui număr mare de analogi și verificarea activității lor biologice, ceea ce a necesitat o mare investiție de timp și bani. În cele din urmă, a fost posibilă utilizarea sintetizatoarelor automate pentru a crea mii de peptide diferite într-un timp scurt. Metodele avansate de mutageneză directă au făcut posibilă, de asemenea, extinderea dramatică a numărului de proteine care pot fi captate la un moment dat și testate în mod constant pentru activitatea biologică. Cu toate acestea, abordările recente ale creării bibliotecilor de peptide au condus la identificarea a milioane de secvențe de aminoacizi necesare pentru screening-ul eficient pentru a identifica peptidele mijlocii care asigură satisfacția maximă.criterii care sunt suspendate. Astfel de biblioteci sunt în curs de dezvoltare pentru a monitoriza interacțiunea anticorpilor cu antigenele, pentru a identifica noi inhibitori de enzime și agenți antimicrobieni, pentru a proiecta molecule care pot avea activitatea biologică necesară sau pentru a oferi noi puteri pentru proteine, cum ar fi anticorpii.
Pe baza metodelor de achiziție, bibliotecile de peptide sunt împărțite în trei grupuri. Primul grup poate include biblioteci derivate din sinteza chimică a peptidelor, în care peptidele individuale sunt imobilizate pe micronoze. Cu această abordare, după adăugarea aminoacizilor de vierme în amestecuri de reacție individuale la peptidele imobilizate pe micronoze, în loc de toate amestecurile de reacție, se combină și sub Utilizare în porții noi, care sunt utilizate în stadiul incipient al ingerării de noi surplusuri de aminoacizi. După efectuarea unor niveluri scăzute ale unor astfel de etape, peptidele sunt sintetizate, ceea ce înlocuiește secvența deficiențelor în sinteza aminoacizilor în diferite tipuri de compuși.
Bibliotecile de peptide imobilizate pe micronoze sunt insuficiente: ele pot fi văzute la screeningul receptorilor purificați vicoristici care sunt într-o formă minoră. În același timp, în majoritatea cazurilor în testele biologice, care sunt efectuate pentru studii fundamentale și farmacologice, se constată cel mai adesea că receptorii asociați cu membranele stagnează. Alternativ, bibliotecile de peptide pot fi separate folosind sinteza de peptide în fază solidă, care implică adăugarea chimică a aminoacizilor de vierme la proteinele peptidice în stadiul pielii, permițându-le să crească și să se formeze în cantități echimolare și toți sau oricare dintre aminoacizii precursori. În etapa finală a sintezei, peptidele sunt întărite din nas, apoi. tradus în formă obișnuită. A treia abordare a construcției de biblioteci de peptide, la a cărei descriere mergem acum mai departe, devenind o adevărată dezvoltare a metodelor de inginerie genetică. Vine ilustrează în mod miraculos fezabilitatea unor astfel de metode și, fără îndoială, marile realizări pe care le-au obținut. În legătură cu aceasta, ne vom uita la raportul privind rezultatele studiului bibliotecilor de peptide în cercetare epitopii(determinant antigenic) proteine.
Tehnologia de inginerie genetică pentru îndepărtarea proteinelor hibride a făcut posibilă dezvoltarea unei metode eficiente de preparare a peptidelor scurte pentru analiza activității lor biologice. Pe lângă un număr mare de biblioteci de gene, biblioteci de peptide, selectate prin metode de inginerie genetică și un set mare (adesea exhaustiv) de peptide scurte. Două progrese recente fac posibilă vizualizarea unei biblioteci de peptide simultan ca o bibliotecă de epitopi de proteine. În primul rând, peptidele scurte pot include toți excesul de aminoacizi majori care joacă un rol major în interacțiunea cu anticorpii și pot avea mari determinanți antigenici ai proteinelor. Cu alte cuvinte, în majoritatea cazurilor există legături necovalente care se creează între cele mai importante surplusuri de aminoacizi ai liganzilor proteici și receptorii acestora, reducând principalele contribuții ale energiei de aprindere reciproc ii ligand-receptor. Privind-o, orice peptidă poate fi văzută ca un potențial ligand, o haptenă sau o parte a determinantului antigenic al polipeptidelor mari, iar o bibliotecă de peptide poate fi văzută ca o bibliotecă de epitopi de proteine sau potențiale proteine. .
Mic II.19. Schema de exprimare a epitopilor peptidici de pe suprafața membranei colifagelor filiforme.
Epitopii peptidici sunt localizați în depozitul de lanjug-uri polipeptidice hibride ale proteinei minore pIII ( A) sau proteina principală pVIII a învelișului viral ( b). Săgețile indică pozițiile epitopilor fragmentelor de oligonucleotide în genomul bacteriofagului, precum și pozițiile epitopilor înșiși. Depozitarea polipeptidei pIII ( A) este afișată doar o copie a epitopului (de fapt, numărul lor ajunge la 4–5)
Biblioteca de peptide, distilată ca urmare a implementării celei de-a treia abordări, pare în prezent a fi o colecție de zeci sau sute de milioane de secvențe scurte care variază, aminoacizi, cum ar fi expres localizați pe suprafața virionilor bacteriofagi în apropierea depozitului. a proteinelor structurale ale umezelii. Acum este posibil să se introducă gene recombinante hibride în genomul bacteriofagelor folosind metode de inginerie genetică pentru a codifica modificări ale proteinelor structurale ale virionilor lor. (Această metodă se numește afișaj fagic.) Ca urmare a exprimării unor astfel de gene, se creează proteine hibride, la capetele N- sau C-terminale ale căror (inferioare) există secvențe suplimentare de aminoacizi. În cel mai bine dezvoltat sistem, care permite construirea de biblioteci de peptide folosind metode de inginerie genetică, sunt izolate colifagul mic filament-like f1 și două proteine: proteinele membranare majore și minore pVIII și pIII. In vivo, proteinele proteice sunt sintetizate sub formă de lănci polipeptidice cu secvențe semnal N-terminale scurte, care sunt scindate de peptidază semnal în timpul maturării lor și transferate în partea interioară a membranei bacteriene. Proteinele mature sunt introduse în membrana bacteriofagului în timpul procesului de colectare. În acest caz, proteina pVIII creează învelișul principal al bacteriofagului, astfel încât fie cinci molecule pIII sunt asociate cu partea terminală a virionului și asigură interacțiunea particulelor virale cu vilozitățile de stare ale celulelor E. coli (Fig. II. 19). Folosind metode de inginerie genetică, peptidele sunt conectate la proteine - direct din secvențele lor N-terminale sau la o distanță mică. Secvențele terminale ale majorității proteinelor sunt mai mari și, de regulă, sunt expuse pe suprafața globului, ceea ce permite ca proteinele recombinante hibride să fie conținute fără nicio distrugere a principalelor autorități de proteine și, de asemenea, fac disponibile peptidele integrate pentru recunoașterea apelurilor. În plus, în această poziție și spațiu, structura peptidelor în sine permite un aflux mai mic de purtător de proteine. În timpul experimentelor, s-a stabilit că introducerea de peptide străine în partea N-terminală a proteinei pIII nu afectează semnificativ viabilitatea și infecțiozitatea particulelor de fagi, în timp ce conexiunea peptidelor nu face decât >5 excese de aminoacizi din Partea N-terminală a proteinei pVIII perturbă plierea virionilor. Dificultatea rămasă poate fi depășită prin livrarea moleculelor de proteină pVIII de tip sălbatic la locul de colectare a virionului, a căror sinteză este mediată direct de gena subgenică a virusului parazitar. În această variantă, învelișul bacteriofagului este susceptibil atât la proteinele pVIII modificate, cât și la polipeptidele de tip sălbatic la virusul gazdă.
Mic II.20. Schemă pentru construirea unui genom viral recombinant pentru a găzdui inserția de oligonucleotide generative pentru a construi o bibliotecă de epitopi
oligonucleotidă Dvolanzyuzhkovy ( A), pentru a găzdui codonii NNK mutați și aceleași site-uri de restricție la depozitul linker, ligați la ADN-ul vectorului Fuse5 ( b), scindate de enzima de restricție Sfi I, odată cu dezvoltarea genomului recombinant ( V), care este sinteza directă a unei proteine recombinate hibride ( G), în care secvența de aminoacizi este atribuită la capătul N-terminal
Când construim o bibliotecă de peptide, mai întâi sintetizăm două oligonucleotide complementare, care apoi creează molecula peptidică, a cărei parte centrală codifică peptida (Fig. II.20, A), iar segmentele cu o singură bandă care ies în afară la capete sunt complementare capetelor „lipicioase” ale vectorului, care sunt eliberate sub acțiunea unei enzime de restricție continuă (div. Fig. II.20, b).
Pentru a codifica aminoacizii peptidelor, folosim codoni derivați de forma NNK sau NNS, care includ toate nucleotidele (N) în prima și alte poziții, G sau T (K), precum și G sau C (S) în pozitia a treia. Cu această abordare, informațiile despre toți cei 20 de aminoacizi și codonul unic sunt localizate în 32 de codoni diferiți NNK și NNS, și nu în 64, ca urmare a codului genetic natural.
În procesul de sinteză a oligonucleotidelor generate care codifică peptide suplimentare, în stadiul pielii, sunt generate nucleotide individuale pentru codonii aminoacizilor invarianți care flanchează porțiunea variabilă a peptidei, precum și Există sume echimolare de nucleotide pentru secțiunile care codifică secvențele specifice. Un set de oligonucleotide generate, care, după ce au fost stabilite ca rezultat, sunt donate în continuare sub formă de fragmente cu o singură bandă la locurile specifice ale genei proteinei membranei bacteriofagului la depozitul vectorului fag sau al fasmidei. O alternativă pentru un astfel de set de oligonucleotide (chimic sau cu ajutorul PLR) este sintetizarea lantelor complementare care conțin inozină în secțiuni variabile, ale căror fragmente rămân, aparent, pereche cu bazele matricei C și T, care se depune Duplexurile corecte sunt create între oligonii corespunzători. Odată create, oligonucleotidele sunt digerate cu enzime de restricție specifice și donate într-un vector fag. Molecule recombinante Pidbag (div. Fig. II.20, V) ADN-ul este introdus în celulele bacteriene, eliminând ~10 9 transformanți la 1 mg de ADN recombinat, particulele fagice care au fost stabilite, se înmulțesc în bacterii și, după purificare, se monitorizează prezența peptidelor recombinate (div. Fig. II.20, G), interacțiuni specifice cu receptorii de urmărire în proteinele virionilor lor.
Numărul de clone de fagi individuale dintr-o bibliotecă este inițial pentru vicorul său. De exemplu, o bibliotecă care conține posibile hexapeptide este responsabilă pentru a conține 64 de milioane (20 6) secvențe diferite de aminoacizi cu șase membri, care sunt codificate de ~ 1 miliard (32 6) hexacodoni diferiți (32 este numărul de codoni, înainte de cu cu ajutorul căruia puteți codifica dacă 20 de aminoacizi sunt sintetizați sau nu într-un mod mai general și, de asemenea, cu codoni vicioși (NNK sau NNS).Pentru a finaliza această sarcină, chiar și bibliotecile mari pot fi eliminate, astfel încât, de exemplu, 2 10 8 – 3 10 8 individual, clone independente, iar valoarea este 10 9 este în prezent limita superioară pentru numărul de clone individuale de bibliotecă care pot fi practic selectate.
Pe baza acestuia, puteți crea un sistem care maximizează surplusul de peptide, care include toate adăugările posibile de 20 de aminoacizi care pot fi utilizați cu ajutorul bibliotecilor suplimentare de peptide, creând un surplus de 6 aminoacizi. Nu este mai puțin important de menționat că o bibliotecă de peptide cu 15 membri de aceeași dimensiune (2-3 × 108 clone) este mai mare decât diferite hexapeptide; o bibliotecă de peptide cu 6 membri este considerată mai jos. În plus, deoarece numărul de excese de aminoacizi dintr-o peptidă indică în mod eficient activitatea sa biologică, o bibliotecă de peptide cu 15 membri poate apărea reprezentativă pentru o bibliotecă mai mare decât cele scurte peptide cu același număr de clone.
Mic II.21. Schemă de selectare a particulelor de fagi care conțin epitopii necesari
Sunt prezentate trei particule de fagi recombinante care exprimă epitopi diferiți în depozitul pIII. Doar epitopul părții centrale a fagului este recunoscut de o moleculă de anticorp biotinilat imobilizat pe o placă Petri cu ajutorul streptavidinei și vicoristanului pentru screening-ul bibliotecii.
Pentru a identifica peptidele din bibliotecă cu activitate biologică care sunt găsite, trebuie utilizate diferite metode de screening. Zocrema, pentru detectarea peptidelor care au epitopi cântec, anticorpi monoclonali biotinilați vicoristic cu o specificitate specifică care sunt imobilizați pe un tampon dur cu ogo streptavidină suplimentară (Fig. II.21). Particulele de fagi care exprimă epitopi similari pe suprafața lor interacționează cu anticorpii și sunt acoperite cu o căptușeală, astfel încât alte particule de fagi recombinante sunt îndepărtate în timpul băii de proces. Particulele de fagi prinse pe căptușeală sunt apoi eluate cu acid, clonele individuale sunt propagate în continuare în celule bacteriene și epitopii exprimați pe acestea sunt supuși diferitelor criterii. Prezența secvențelor de nucleotide identice sau similare în mijlocul secvențelor donate indică specificitatea procesului de purificare. Clonele individuale sunt apoi caracterizate prin alte metode, inclusiv metode imunoenzimatice. În etapa finală a investigației are loc sinteza peptidelor identificate și prelucrarea lor completă în stare purificată.
În prezent există informații despre lucrările efectuate pe bibliotecile de peptide. Într-un astfel de studiu de bibliotecă, s-au observat peptide ale căror secvențe de aminoacizi diferă brusc de secvența de aminoacizi a adevăratului epitop al antigenului monitorizat. Timpul nu este mai mic, o astfel de peptidă se leagă strâns de anticorpi specifici și concurează pentru legarea la un antigen natural. Acest lucru ne-a permis să dezvoltăm cunoștințe despre posibilitatea somnului mimotopi- peptide scurte care au epitopi naturali, ale căror secvențe de aminoacizi diferă foarte mult între ele. A fost posibil să se stabilească secvențele canonice de aminoacizi ai peptidelor care au epitopi ai proteinelor naturale și, printre acestea, să se identifice reziduurile de aminoacizi care joacă un rol cheie în interacțiunea ii antigen-anticorp.
Una dintre cele mai bogate contribuții ale bibliotecilor de peptide este identificarea liganzilor peptidici care au epitopi „structurali” care sunt creați pe suprafața globulelor proteice ca urmare a arderii câmpului lor.lance peptidice, care este însoțită de proximitatea mare de amino excesele acide, care sunt separate de excesele polipeptidice. Cu ajutorul bibliotecilor de peptide, este posibil să se identifice analogi ai peptidelor diferiților epitopi de natură non-proteică. Evident, în viitorul apropiat va fi posibil să se utilizeze biblioteci de peptide pentru a identifica noi medicamente, a dezvolta metode de diagnosticare și a dezvolta vaccinuri eficiente. În Galusa, proiectarea de noi medicamente de către cercetători ar putea fi direcționată către crearea de liganzi peptidici care interacționează în mod specific cu receptorii, ceea ce este de interes medical și biologic. Cunoașterea structurii unor astfel de liganzi ar facilita dezvoltarea medicamentelor non-proteice pe această bază.
Bibliotecile de peptide și epitopi își vor găsi acumularea în investigarea mecanismelor sistemului imunitar umoral, precum și a bolii sistemului imunitar. Zokrem, majoritatea bolilor autoimune sunt însoțite de dezvoltarea de autoanticorpi împotriva antigenelor din organism. Acești anticorpi sunt în multe cazuri markeri specifici ai altor boli autoimune. În principiu, este posibil să se identifice markeri peptidici dintr-o bibliotecă diversă de epitopi, în plus față de care ar fi posibilă monitorizarea specificității autoanticorpilor în timpul dezvoltării unui proces patologic atât într-un organism individual, cât și în grupuri de pacienți și, în plus, determinați specificitatea autoanticorpilor în cazurile de boală cu etiologie necunoscută.
Bibliotecile de peptide și epitopi pot fi, potențial, utilizate și pentru screeningul serurilor imune prin identificarea peptidelor care interacționează în mod specific cu anticorpii chimici. Astfel de peptide au determinanți antigenici împotriva organismelor patogene și servesc ca ținte pentru anticorpii chimici din organism. Este posibil să se utilizeze peptide similare pentru vaccinarea pacienților, care nu produc anticorpi împotriva agenților patogeni similari. Studiul epitopilor cu ajutorul bibliotecilor de peptide este completat de apariția uneia dintre numeroasele lor direcții în cercetarea aplicată și fundamentală privind interacțiunea liganzilor și receptorilor. O rafinare suplimentară a acestei abordări poate duce la dezvoltarea de noi medicamente bazate pe peptide scurte și bazate pe cercetarea fundamentală a mecanismelor interacțiunilor proteină-proteină.
În literatura revizuită, peptidele rămase sunt legate covalent la proteina purtătoare. Acest tip de miros este unul dintre reprezentanții proteinelor hibride care sunt generate prin metode de inginerie genetică.
În alte cazuri, proteinele hibride sunt folosite pentru a obține un nivel ridicat de expresie a peptidelor scurte în celulele bacteriene datorită stabilizării acestor peptide în depozitarea proteinelor hibride. Proteinele hibride sunt adesea folosite pentru a identifica și purifica proteine recombinante importante. De exemplu, după ce a ajuns la capătul C-terminal al proteinei urmărite ca o proteină raportoare a α-galactozidazei, este posibil să se purifice proteina recombinată pentru activitatea a-galactozidazei, ceea ce înseamnă determinanți antigenici ai sistemului imunitar, folosind metode blânde. . Prin combinarea fragmentelor de ADN care combină cadrele de citire deschise (ORF) cu gene ale proteinei reporter, este posibilă purificarea unor astfel de proteine hibride pentru activitatea proteinei reporter și a le ținti pentru imunizare, creaturi de laborator. Anticorpii au fost îndepărtați și lăsați să stea pentru purificarea proteinei native, care conține polipeptida recombinantă codificată de ORF, și apoi fragmentul de genă donat este identificat.
Cu ajutorul proteinelor hibride, sarcina de a clona o genă necunoscută este rezolvată în produsul proteic al cărui anticorp este. În acest caz, este construită o bibliotecă de secvențe de nucleotide, care reprezintă ORF-ul genelor necunoscute, în vectori care permit conectarea ORF-ului care este donat în același cadru de citire ca și gena raportor. Proteinele hibride care sunt create ca urmare a exprimării acestor gene recombinante sunt identificate cu anticorpi suplimentari prin metode imunosorbente legate de enzime. Gbridni Geni, secretarul Shodnoye Bilki I Bilki-Rapoarte, da un nou doslіjuvati mecanizat la mâna a doua, și o astfel de lăcustă mă mișc în țesături Bilkiv, ShO Secret.
Toxine hibride
Lucrări de serie I. Pastana cu dezvoltarea de toxine hibride directe ilustrează puterea ingineriei proteinelor prin combinarea diferitelor domenii funcționale ale proteinelor pentru a obține efecte biologice specifice.
Mic II.22. Preparate medicinale cu acțiune directă pe bază de toxine hibride
A- Schema de structură a medicamentului cu acțiune directă a fost actualizată; b- toxina Budova pseudomonas (cifrele indică poziția surplusurilor de aminoacizi); V– Toxina hibrid Budova; G– toxină hibridă pe bază de anticorpi monoclonali
Tratamentul medical ideal pentru o alegere foarte specifică se datorează caracteristicilor structurale și funcționale subiacente (Fig. II.22, A). Un astfel de medicament trebuie să lege stiulețul activ pentru a obține un efect fiziologic și un ligand care recunoaște receptorul de pe suprafața celulelor țintă. În plus, elementele structurale care sunt recunoscute de sistemul de transport al organismului sunt, de asemenea, responsabile pentru livrarea lichidelor către celulele țintă, precum și secțiunea distanțier, care necesită separarea urechii următoare de alte funcții părți naționale ale medicamentului dupa livrarea acestuia la adresa. Această schemă ideală este implementată în exotoxina naturală Pseudomonas aeruginosa. Exotoxina A P. aeruginosa este o proteină care este alcătuită dintr-un lanț polipeptidic de 613 aminoacizi, care este organizat în trei domenii funcționale (div. Fig. II.22, b). Domeniul N-terminal Ia (reziduurile de aminoacizi 1-252) este necesar pentru interacțiunea cu suprafața celulelor țintă (prototipul ligandului ideal de acțiune directă). Funcțiile domeniului Ib (reziduuri de aminoacizi 365-404) sunt necunoscute. Domeniul II (rezervele de aminoacizi 253-364) asigură transferul eficient al toxinei în citosol (sistemul de transport litic), iar domeniul III (rezervele de aminoacizi 405-613) facilitează ADP-ribozilarea factorului de alungire a translației ї EF2, care ar trebui folosit pentru a suprima transmiterea țintelor. Astfel, pentru ca acțiunea citotoxică a exotoxinei A să aibă loc, este necesar ca domeniul Ia să recunoască receptorul de pe suprafața celulelor, să pătrundă în celule prin endocitoză mediată de receptori și apoi să se transloce prin membrana interioară în citosol, de localizare. Se numește factorul EF2. Ideea principală de a crea toxine directe a fost înlocuirea domeniului Ia cu un alt ligand peptidic care interacționează cu un alt grup de receptori de pe suprafața celulelor și, prin urmare, modificarea specificității. Puritatea acestei toxine este similară cu celulele în sine (div. Fig. II. 22, V).
S-a constatat că îndepărtarea domeniului Ia prin metode de inginerie genetică reduce brusc (de sute și mii de ori) toxicitatea unei astfel de proteine scurtate, atât în celulele de linii diferite, cât și in vivo. Prin adăugarea la partea C-terminală a polipeptidei trunchiate a moleculei de interleukină, 2 persoane au putut combina părțile structurale ale genelor de subtip într-un vector care exprimă. S-a constatat că toxina hibridă este extrem de toxică, deoarece celulele, care poartă receptori de interleukină 2 pe suprafața lor, nu au acționat asupra celulelor, care aveau receptori zile întregi și au murit sub influența toxinei naturale. Internalizarea(Translocarea peste celule) a toxinei hibride este mediată de subunitățile p55 și p70 ale receptorului de interleukină 2. Astfel, ca urmare a efectului toxinei hibride asupra populației de celule, unele dintre ele sunt exprimate pe suprafața lor Și receptorii pentru interleukina 2 au ca rezultat moartea selectivă a acestor celule în sine.
În organism, majoritatea celulelor T în repaus și a celulelor T de memorie nu exprimă receptori de interleukină 2 de mare afinitate pe suprafața lor, astfel încât celulele T, stimulate de aloantigene, acționează asupra acestor receptori. Prin urmare, administrarea internă a unei toxine hibride la pacienții cu artrită experimentală - boli cauzate de activarea patologică a T-clitinei - a redus simptomele bolii. Toxina hibridă a modificat semnificativ reacția de transplant la șoareci.
În urma acestor roboți de pionierat, a existat o serie întreagă de studii îndreptate către dezvoltarea unor sisteme similare pentru livrarea țintită a diferitelor polipeptide citotoxice. În procesul de modernizare ulterioară a sistemului de eliberare țintită a toxinei pseudomonas cu interleukina 2, s-a descoperit că ligandul a fost îndepărtat permanent din domeniul de adresă al toxinei și a fost înconjurat de inactivarea sa prin introducerea a patru toxine în mutațiile specifice ale genei. . Moleculele unei astfel de toxine hibride s-au dovedit a fi agenți citotoxici de 10-100 de ori mai eficienți împotriva celulelor umane și a MAP-urilor care exprimă receptori pentru interleukina 2 pe suprafața lor, precum și o oră puțin mai lungă de băut în sânge și șoarecii in vivo au fost. reparat dintr-o structură îndepărtată anterior.
Pe baza toxinei pseudomonas s-au creat toxine hibride care au fost combinate cu liganzi polipeptidici interleukina 4, interleukina 6, factorul de creștere transformator de tip A și factorul de creștere asemănător insulinei I. Pentru toate aceste proteine hibride este indicată proteina cu specificitate ridicată. ), care sunt principalii receptori. Fuziunea toxinei hibride cu ligandul unei părți a polipeptidei CD4 – o glicoproteină de pe suprafața clitinei T, care este receptorul virusului VIL și interacționează cu glicoproteina sa gp120, a permis celulele T infectate cu invazie vibrațională. virusul VIL exprima2 pe suprafata lor.
Același principiu de suprimare a infecției cauzate de virusurile HIV, diferiții receptori CD4 vor fi victorioși în proiectarea proteinelor hibride, care vor combina părți ale lanjug-urilor polipeptidei CD4 cu părțile constante ale lanjug-urilor importante sau pulmonare la persoanele cu imunoglobuline. În procesul de combinare a genelor, secvențele de nucleotide au fost îndepărtate care codifică domeniile transmembranare și citoplasmatice ale CD4, precum și partea variabilă a lancinogenilor polipeptidici ai imunoglobulinelor. Moleculele hibride care sunt stabilizate se numesc imunoadezinele, pentru structura părții constante a moleculei de imunoglobuline s-a realizat o stabilitate crescută în organism și, în plus, s-au păstrat puteri specifice, mediate de părțile constante ale imunoglobulinelor: legătura Baia dintre receptorul Fc și proteina A, creată. înainte de fixare prin complement și transferat prin bariera placentară. Combinația tuturor acestor puteri a făcut posibil ca imunoadezinele să întrerupă eficient infecția celulelor T cu virusul HIV-I, blocând atât virusul în sine, cât și celulele infectate cu acesta care exprimă virusul pe antigenul gp120 de suprafață.
Dezvoltarea ulterioară a constructelor de inginerie genetică bazată pe exotoxină pseudomonadă Și a devenit posibilă după ce domeniile variabile ale anticorpilor monoclonali au început să fie convertite în componenta p55 a receptorului de interleukină la 2 persoane din partea de adresă a toxinei hibride. În această proteină recombinantă, cu ajutorul unui linker suplimentar de aminoacizi peptidic cu 15 benzi, domeniul variabil al imunoglobulinei importante Lancug a fost conectat cu domeniul variabil al plămânului, iar capătul C-terminal al plămânului a fost conectat cu N. - sfârşitul toxinei pseudomonas scurtate. G). Astfel de molecule de toxine hibride s-au dovedit, de asemenea, a fi agenți citotoxici foarte specifici ai celulelor leucemice umane care exprimă receptorii de interleukină 2 pe suprafața lor.
O abordare cuprinzătoare a demonstrat potențialul de dezvoltare a anticorpilor specifici ca părți vizate ale toxinelor hibride. Acest lucru aduce în mâinile predecesorilor noștri o metodă universală de livrare țintită a toxinelor, care ne poate permite să conferim un efect citotoxic oricărui grup de celule care exprimă antigeni specifici pe suprafața lor. Extinde semnificativ gama de ținte pentru acțiuni chimioterapeutice folosind proteine recombinante vicioase.
Crema de exotoxina A pseudomonas ca stiuleț de lucru în toxine hibride a fost combinată cu succes cu toxina difterice, factorul de necroză puffin și ricina A-lancinat. Fragmente de proteine A interacționează vibrat cu părțile constante (Fc) ale compușilor bogati în imunoglobuline din clasa G, cum ar fi o toxină hibridă asociată cu imunoglobulină, este izolată împotriva oricărui antigen de pe suprafața celulelor, comunică vibrat cu aceste celule și le ucide. Astfel de imunotoxine sunt un alt potențial agent antitumoral și pot acționa împotriva celulelor care exprimă antigeni specifici pe suprafața lor.
Mic II.23. Proteina hibridă Victory pentru reglarea expresiei genelor
Metodele de inginerie genetică dezvăluie posibilitățile nesfârșite de a proiecta noi proteine prin combinarea diferitelor combinații de diferite domenii funcționale ale proteinelor polipeptidice. Îndepărtarea toxinelor hibride prin acțiune directă ilustrează potențialul acestei abordări a ingineriei proteinelor. Ca o ilustrare suplimentară a capacităților acestui grup de metode, considerăm proteina hibridă ca un nou regulator al activității genelor. La construirea unei astfel de proteine folosind metode de inginerie genetică, domeniul de legare a ADN al receptorului hormonului glucocorticoid a fost înlocuit cu un domeniu specific al represorului E. coli LexA (Fig. II.23).
Introducerea secvenței genelor operator lexAîn regiunea promotorului genei globinei (sau a altor gene) a condus la activarea promotorului sub influența unei proteine hibride în prezența dexametazonei - un hormon sintetic care interacționează cu receptorul glucocorticoid. Astfel, noua genetică are o secvență precisă de nucleotide a operatorului genei lexA E. coli a funcționat ca un amplificator de transcripție în prezența unei proteine activatoare hibride, care este recunoscută prin secvența sa. Rezultatele robotului demonstrează posibilitatea creării de noi proteine - regulatori ai activității genelor prin combinarea domeniilor funcționale cunoscute.
Dezvoltarea ingineriei proteinelor este în mare măsură condusă de cunoașterea limitată a relațiilor structural-funcționale din proteine, ceea ce duce la complexitatea obiectului investigației. Lucrările numerice create pentru dezvoltarea unor astfel de legături se presupune a fi de natură empirică și se termină cu localizarea aminoacizilor, funcțiile esențiale ale centrilor activi ai enzimelor. Prin urmare, sarcina principală a ingineriei proteinelor este de a elimina proteinele de la autoritățile date în funcție de consistența exceselor de aminoacizi - este încă departe de a fi permis. Nu este mai puțin adevărat că acum se încearcă schimbarea directă a puterii enzimelor naturale prin înlocuirea unei cantități mici de polipeptide în exces de aminoacizi cu ajutorul mutagenezei directe.