БІЛКОВА ІНЖЕНЕРІЯ, напрям молекулярної біології та біоінженерії, до завдань якого входять цілеспрямована зміна структури природних білків та отримання нових білків із заданими властивостями. Білкова інженерія виникла на початку 1980-х років, коли були розроблені методи генетичної інженерії, що дозволили отримувати різні природні білки за допомогою бактерій або дріжджів, а також певним чином змінювати структуру генів і, відповідно, амінокислотну послідовність (первинну структуру) білків, що кодуються. Виходячи з принципів організації білкових молекул, взаємозв'язку структури та функції білків, білкова інженерія створює науково обґрунтовану технологію спрямованої зміни їхньої структури. За допомогою білкової інженерії вдається підвищувати термостабільність білків, їх стійкість до впливів, що денатурують, органічним розчинникам, змінювати лігандзв'язувальні властивості. Білкова інженерія дозволяє шляхом заміни амінокислот покращувати роботу ферментів та їхню специфічність, змінювати оптимальні значення pH, при яких працює фермент, виключати небажані побічні активності, усувати ділянки молекул, інгібуючі ферментативні реакції, підвищувати ефективність білкових лікарських препаратів тощо. Наприклад, заміна лише одного залишку треоніну на залишок аланіну або проліну дозволила в 50 разів підвищити активність ферменту тирозилтРНК-синтетази, а завдяки заміні 8 амінокислотних залишків так звана термолізин-подібна протеаза з Bacillus stearothermophilus набула здатність зберігати2 . До білкової інженерії можна віднести також роботи з спрямованої зміни властивостей білків за допомогою хімічних модифікацій, наприклад введення фотоактивованих сполук, що змінюють властивості молекули під дією світла, з'єднань-міток, що дозволяють відстежувати шляхи переміщення білка в клітині або направляти його до різних компонентів клітини, і тому подібне. Такі роботи проводяться переважно на рекомбінантних білках, одержуваних генно-інженерними методами.
У білковій інженерії можна назвати два напрями: раціональний дизайн і спрямована молекулярна еволюція білків. Перше має на увазі використання інформації про структурно-функціональні відносини в білках, одержуваної за допомогою фізико-хімічних та біологічних методів, а також комп'ютерного молекулярного моделювання, щоб визначити, які саме зміни в первинній структурі повинні привести до бажаного результату. Так, для підвищення термостабільності білка необхідно визначити його просторову структуру, виявити «слабкі» ділянки (наприклад, амінокислоти, недостатньо пов'язані зі своїм оточенням), підібрати для них найкращі варіанти замін на інші амінокислоти за допомогою молекулярного моделювання та оптимізації енергетичних параметрів молекули; після цього піддати мутації відповідний ген, а потім отримати та дослідити мутантний білок. Якщо цей білок не відповідає заданим параметрам, проводять новий аналіз і повторюють описаний цикл. Такий підхід найчастіше використовується у разі конструювання штучних білків (білків de novo) із заданими властивостями, коли на вході є нова амінокислотна послідовність, в основному або повністю задана людиною, а на виході – білкова молекула з бажаними характеристиками. Поки, однак, таким чином вдається отримувати лише невеликі білки de novo з нескладною просторовою структурою та вводити в них прості функціональні активності, наприклад, металзв'язувальні ділянки або короткі пептидні фрагменти, що несуть будь-які біологічні функції.
При спрямованій молекулярній еволюції білків за допомогою генно-інженерних методів отримують великий набір різних мутантних генів цільового білка, які потім експресують спеціальним чином, зокрема на поверхні фагів («фаговий дисплей») або в бактеріальних клітинах, щоб зробити можливим відбір мутантів з найкращими характеристиками. З цією метою, наприклад, гени потрібного білка або його частин вбудовуються геном фага - до складу гена, що кодує білок, розташований на поверхні фагової частинки. При цьому кожен індивідуальний фаг несе свій мутантний білок, що має певні властивості, якими робиться відбір. Мутантні гени отримують шляхом «перемішування» набору генів подібних природних білків різних організмів, як правило, за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції, так що кожен одержуваний мутантний білок може включати фрагменти багатьох «батьківських» білків. Насправді, цей підхід імітує природну еволюцію білків, але тільки значно швидшими темпами. Основне завдання білкового інженера в даному випадку полягає в розробці ефективної системи, що селектує, яка дозволить відбирати кращі мутантні варіанти білків з потрібними параметрами. У разі вищезазначеного завдання - підвищити термостабільність білка - відбір можна вести, наприклад, шляхом вирощування клітин, що містять мутантні гени, за підвищеної температури (за умови, що присутність у клітині мутантного білка збільшує її термічну стійкість).
Обидва названі напрямки білкової інженерії мають одну мету і доповнюють одна одну. Так, дослідження одержуваних за допомогою методів молекулярної еволюції мутантних варіантів білків дозволяє краще зрозуміти структурно-функціональну організацію білкових молекул і використовувати знання для цілеспрямованого раціонального дизайну нових білків. Подальший розвиток білкової інженерії дає можливість вирішувати багато практичних завдань щодо покращення природних та отримання нових білків для потреб медицини, сільського господарства, біотехнології. У майбутньому можливе створення білків, що мають функції, невідомі в живій природі.
Літ.: Brannigan J.А., Wilkinson А.J. Protein engineering 20 years on // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. № 12; Патрушев Л. І. Штучні генетичні системи. М., 2004. Т. 1: Генна та білкова інженерія.
Методи генетичної інженерії, зокрема клонування індивідуальних генів чи його частин, і навіть секвенування ДНК, дозволили значно удосконалити методологію мутагенезу, усунувши основні недоліки класичних способів індукції мутацій в геномах. Класичний генетичний аналіз передбачає вплив мутагенного фактора in vivo на цілий геном, внаслідок чого в ньому виникають випадкові мутації, часто множинні, що ускладнює ідентифікацію мутантів. Виявлення мутантних особин здійснюють за зміненими фенотиповими ознаками, а природу мутації можна визначити після секвенування ДНК. Сучасний локалізований мутагенез, по суті, передбачає зворотні дії: спочатку клонують ген або його сегмент, що цікавить, визначають його структуру в ході секвенування, а потім in vitro вносять необхідні зміни до його складу. Наслідки спричиненої мутації визначають після введення мутантного гена у вихідний організм.
Найпростіший варіант локалізованого мутагенезу полягає в обробці клонованого фрагмента ДНК одним з мутагенних факторів, проте результатом такого впливу будуть також випадкові зміни у структурі фрагмента. Більш надійні та найчастіше застосовувані методи локалізованого мутагенезу здійснюються без використання мутагенних факторів. Серед типів мутацій переважають делеції, вставки та заміни нуклеотидів.
розподілу.Ці типи мутацій при локалізованому мутагенезі одержують за допомогою ендонуклеаз. Використовують як рестрикуючі, так і неспецифічні ендонуклеази. Найбільш простий випадок використання рестриктазу полягає в розщепленні будь-якого геному за допомогою рестриктази, що вносить кілька розривів з утворенням липких кінців. Отримані фрагменти знову замикають у кільце за допомогою ДНК-лігази, що може призвести до утворення молекул, що не містять один із сегментів ДНК. При такому підході формуються протяжні делеції і його використовують, як правило, в попередніх експериментах, щоб визначити функції щодо великих ділянок клонованої ДНК.
Невеликі делеції одержують в такий спосіб. Клонований фрагмент розщеплюють у складі вектора у відповідному сайті за допомогою рестриктази (рис. 21.1). Лінійну молекулу, що утворилася, обробляють екзонуклеазою III, яка гідролізує в складі ДНК один ланцюг,
починаючи з 3'-кінця. В результаті виходить набір молекул з одноланцюжковими 5'-хвостами різної протяжності. Ці хвости гідролізують нуклеазою S1, специфічною до одноланцюгової ДНК, і ДНК формуються делеції. Можна також застосовувати екзонуклеазу Bal 31, яка каталізує деградацію обох ланцюгів, починаючи з кінців лінійних молекул ДНК. Хід нуклеотичних реакцій регулюють, варіюючи час інкубації, температуру і концентрацію ферменту, індукуючи утворення делецій різної довжини. Отримані делеційні варіанти лінійних ДНК часто перед циклізацією постачають лінкерами, щоб у районі делеції були присутні рестрикційні сайти. Існують інші модифікації описаних методів.
Вставлення (інсерції).Для отримання інсерцій клоновану ДНК розщеплюють рестриктазою або неспецифічною ендонуклеазою, а потім лігують фрагменти, що утворюються в присутності сегмента, який хочуть вставити в ДНК. Найчастіше як такі сегменти використовують синтезовані хімічним шляхом полілінкери (глава 20).
Інсерції, як і делеції, здатні порушити цілісність гена або структуру його регуляторних областей, в результаті чого буде синтезуватися дефектний білок (у разі протяжних делецій або зсуву рамки зчитування, як правило, неактивний) або будуть спостерігатися зміни процесу транскрипції гена, що цікавить. Таким способом частіше отримують регуляторні мутанти і конструюють вектори, що експресуються (глава 20).
Точкові мутації . Ці мутації є заміною нуклеотидів. Для їх отримання можна використовувати декілька підходів: дезамінування цитозину, включення аналогів нуклеотидів, неправильне включення нуклеотидів при репарації пробілу та ін.
Перший спосіб заснований на тому, що залишки цитозину в одноланцюжковій ДНК можна дезамінувати з утворенням урацилу за допомогою бісульфіту обробки іонами. Одноланцюгові ділянки ДНК отримують зазвичай поблизу сайтів рестрикції, наприклад, при дії экзонуклеази III. Після обробки бісульфітом одноланцюжкові проломи забудовують за допомогою ДНК-полімерази та лігують кінці. У сайтах, де замість цитидилату при дезамінуванні утворився уридилат, комплементарне становище займе аденілат, а при реплікації такої молекули відбудеться заміна пари GC на пару AT.
Інший підхід при індукції замін полягає в обробці клонованої ДНК будь-якої рестриктази в присутності бромистого етидія, який вбудовується між площинами пар основ і вносить порушення в структуру дуплексу. У результаті утворюється лише однонитковий розрив ДНК. У місці однониткового розриву створюють невелику прогалину, а потім забудовують його в присутності ДНК-полімерази, dATP, dGTP, dCTP та N-4-гідроксицитозинтрифосфату замість dTTP. Гідроксицитозинтрифосфат включається до ланцюга замість тимідилату, але при реплікації ДНК спарується однаково добре і з аденілатом, і з гуанілатом. В результаті включення гуанілат після додаткового раунду реплікації в даному сайті відбудеться заміна АТ→GC (рис. 21.2). Оскільки в даному методі заміна нуклеотидів здійснюється всередині
сайту рестрикції, з'являється можливість легко розрізнити вектори з вихідною послідовністю та мутантні. Для цього достатньо обробити їх рестриктазою, що використовується в експерименті: мутантні молекули не піддадуться розщепленню.
Схожий метод заснований на використанні лише трьох із чотирьох можливих нуклеотидів при заповненні однониткового пролому ДНК-полімеразою. Найчастіше фермент зупиняється там молекули, де зустрічається комплементарний відсутньому нуклеотид. Однак зрідка ДНК-полімераза помиляється і включає один із трьох присутніх нуклеотидів. Це призводить до утворення кільцевих молекул, у складі яких присутні неспарені некомплементарні азотисті основи. При введенні таких векторів клітини бактерій у частині молекул відбудеться репарація такого пошкодження. В результаті половини молекул після реплікації відновиться вихідна послідовність, а в іншій половині закріпиться мутація. Відрізнити мутантні молекули можна описаним вище способом.
Сайт-специфічний мутагенез. Охарактеризовані методи локалізованого мутагенезу відрізняються тим, що сайти, де відбуваються мутації, вибираються випадково. У той же час техніка сайт-специфічного мутагенезу дозволяє вводити мутації в певну ділянку гена. Це здійснюється з використанням синтетичних (отриманих хімічним синтезом) олігонуклеотидів із заданою послідовністю. Метод зручний тим, що не потребує зручних сайтів рестрикції. В основу методу покладено утворення гетеродуплексів між синтетичним олігонуклеотидом, що містить мутацію, та комплементарної однониткової ДНК у складі вектора.
Надходять у такий спосіб. Синтезують невеликий олигонуклеотид (8-20 мономерів), комплементарний тій частині гена, де хочуть отримати мутацію. У складі олігонуклеотиду в центральній ділянці допускають одну або кілька нуклеотидних замін. Клонують досліджуваний ген або його фрагмент у складі вектора на основі фага М13, щоб одержати кільцеві одноланцюгові рекомбінатні ДНК. Виробляють змішування та відпал рекомбінантних векторів з олігонуклеотидами. Відбувається гібридизація олігонуклеотиду з комплементарною областю, причому некомплементарні нуклеотиди залишаються неспареними. Олігонуклеотид виконує роль праймера полімеразної реакції за участю ДНК-полімерази in vitro. Кільце замикають лігазами. Отримана кільцева молекула вводиться клітини E.coli, де відбувається часткова репарація мутантних ділянок реплікація. Частота мутацій зазвичай варіює від 1 до 50%. Відбір клітин, що містять мутантні молекули ДНК, можна проводити кількома способами, серед яких переваги має метод з використанням радіоактивно міченого олигонуклеотида, який застосовується для мутагенезу. У разі цей нуклеотид служить зондом. Принцип використання такого зонда заснований на тому, що він повністю комплементарний мутантної ДНК і частково комплементарний ДНК дикого типу. Можна підібрати такі умови гібридизації (насамперед, температуру), що гібридизація міченого зонда буде стабільною лише з мутантною послідовністю ДНК, що можна виявити на радіоавтографі.
Метод сайт-специфічного мутагенезу особливо цінний тим, що дозволяє ізолювати мутації без контролю їхнього фенотипного прояву. Цей метод відкриває нові можливості дослідження функцій регуляторних елементів генів, дозволяє змінювати силу промоторів, оптимізувати сайти зв'язування з рибосомами і т. д. Одним з основних застосувань даної методології є білкова інженерія.
Білкова інженерія. Цим словосполученням позначають комплекс методичних прийомів, які дозволяють реконструювати молекулу білка шляхом спрямованого введення відповідних мутацій у структурний ген (сайт-специфічний мутагенез) і, отже, бажаних замін амінокислот в первинну структуру білка.
Показовим прикладом конструювання активніших білків є експерименти Фершта і співробітників з ферментом тирозил-тРНК-синтетазою з бактерій Bacillus stearothermophilus. Аналіз наслідків замін амінокислот в активному центрі цього ферменту дозволив зробити висновок, що видалення груп, що утворюють із субстратом слабкі водневі зв'язки, може покращити його спорідненість до субстрату. При цьому виявлено, що треонін-51 (займає положення 51 у складі пептиду) утворює довгий і слабкий водневий зв'язок з киснем кільця рибози при зв'язуванні тирозиладенілату. У той же час виявлено, що у бактерій E.coli таке ж положення займає пролін. Сайт-специфічний мутагенез гена, що визначає структуру тирозил-тРНК-синтетази B.stearothermophilus, дозволив забезпечити заміну thr-51→pro -51у пептиді. В результаті різко покращилося зв'язування АТР в активному центрі ферменту, яке каталітична активність зросла в 25 разів.
Іншим, не менш значущим прикладом реконструкції білка, що має практичне значення, є модифікація субтилізину Bacillus amyloliquefaciens, здійснена Естеллом і співавторами. Субтилізини є сериновими протеїназами, що секретуються бацилами в зовнішнє середовище. Ці ферменти випускаються біотехнологічною промисловістю у великих масштабах і широко використовуються у складі миючих засобів. Недоліком субтилізинів є різке зменшення протеолітичної активності під дією окислювачів, у тому числі у пральних порошках. Завдання реконструкції молекули субтилізину BPN полягала у стабілізації його до хімічного окиснення.
У попередніх експериментах було встановлено, що в присутності перекису водню субтилізин швидко знижує активність за рахунок окислення залишку метіоніну-222, що перетворюється на відповідний сульфоксид. Методами сайт-специфічного мутагенезу було забезпечено заміну цього залишку метіоніну на решту 19 білкових амінокислот. Плазміди з мутантними генами вводили в штами з делеціями у відповідних генах і аналізували властивості субтилізинів, що продукуються. Достатньо стабільними до дії перекису виявилися мутанти із серином та аланіном222. Найактивнішим виявився мутант, що містить залишок цистеїну-222, його питома активність на 38% перевищувала активність штаму дикого типу.
Аналогічним шляхом вдалося підвищити активність b-інтерферону. Серед інших досягнень білкової інженерії можна назвати дослідження з'ясування трансформуючої активності онкобілків; зміна термостабільності ферментів, наприклад, отримання термолабільного реніну і термостабільної a-амілази; збільшення ефективності зв'язування інсуліну відповідним рецептором плазматичної мембрани за рахунок заміни гістидину на аспартат у положенні 10 b-ланцюга гормону, а також безліч інших прикладів. Багато продуктів білкової інженерії вже знайшло практичне застосування у виробничих процесах.
Курсова робота
з дисципліни: Сільськогосподарська біотехнологія
на тему: «Білкова інженерія»
Вступ. Білкова інженерія
1 Поняття білкової інженерії. Історія розвитку
2 Стратегії білкової інженерії. Приклад інженерних білків. Застосування білкової інженерії
1 Бібліотеки пептидів та епітопів
2 Білки-репортери у гібридних білках
3 Деякі досягнення білкової інженерії.
Висновок
Список літератури
Реферат
Тема роботи: Білкова інженерія.
Ключові слова: біотехнологія, генна інженерія, білок, генетичний код, ген, ДНК, РНК, АТФ, пептиди, епітоп.
Мета курсової роботи: вивчення поняття «білкова інженерія» та потенційних можливостей її використання.
Потенційні можливості білкової інженерії:
Змінивши міцність зв'язування речовини, що перетворюється, - субстрату - з ферментом, можна підвищити загальну каталітичну ефективність ферментативної реакції.
Підвищивши стабільність білка в широкому діапазоні температур та кислотності середовища, можна використовувати його в умовах, за яких вихідний білок денатурує та втрачає свою активність.
Створивши білки, здатні функціонувати безводних розчинниках, можна здійснювати каталітичні реакції в нефізіологічних умовах.
Змінивши каталітичний центр ферменту, можна підвищити його специфічність та зменшити кількість небажаних побічних реакцій
Підвищивши стійкість білка до ферментів, що його розщеплюють, можна спростити процедуру його очищення.
Змінивши білок таким чином, щоб він міг функціонувати без звичайного для нього амінокислотного компонента (вітаміну, атома металу тощо), можна використовувати його в деяких безперервних технологічних процесах.
Змінивши структуру регуляторних ділянок ферменту, можна зменшити ступінь його гальмування продуктом ферментативної реакції на кшталт негативної зворотний зв'язок і цим збільшити вихід продукту.
Можна створити гібридний білок, що має функції двох і більше білків.
Можна створити гібридний білок, одна з ділянок якого полегшує вихід гібридного білка з клітини, що культивується, або вилучення його з суміші.
Вступ
З давніх-давен біотехнологія застосовувалася переважно в харчовій і легкій промисловості: у виноробстві, хлібопеченні, зброджуванні молочних продуктів, при обробці льону і шкір, заснованих на застосуванні мікроорганізмів. Останні десятиліття можливості біотехнології надзвичайно розширилися. Це пов'язано з тим, що її методи вигідніші за звичайні з тієї простої причини, що в живих організмах біохімічні реакції, що каталізуються ферментами, йдуть за оптимальних умов (температури і тиску), більш продуктивні, екологічно чисті і не вимагають хімічних реактивів, що отруюють середовище.
Об'єктами біотехнології є численні представники груп живих організмів - мікроорганізми (віруси, бактерії, найпростіші, дріжджові гриби), рослини, тварини, і навіть ізольовані їх клітини і субклітинні компоненти (органели) і навіть ферменти. Біотехнологія базується на фізіолого-біохімічних процесах, що протікають в живих системах, в результаті яких здійснюються виділення енергії, синтез і розщеплення продуктів метаболізму, формування хімічних і структурних компонентів клітини.
Головним напрямком біотехнології є виробництво за допомогою мікроорганізмів та культивованих еукаріотичних клітин біологічно активних сполук (ферменти, вітаміни, гормони), лікарських препаратів (антибіотики, вакцини, сироватки, високоспецифічні антитіла та ін.), а також цінних сполук (кормові добавки амінокислоти, кормові білки і т. д.).
Методи генетичної інженерії дозволили здійснити синтез у промислових кількостях таких гормонів, як інсулін та соматотропін (гормон росту), які необхідні для лікування генетичних хвороб людини.
Біотехнологія вирішує не лише конкретні завдання науки та виробництва. Вона має більш глобальна методологічна завдання - вона розширює і прискорює масштаби впливу людини на живу природу і сприяє адаптації живих систем до умов існування людини, тобто до ноосфери. Біотехнологія, таким чином, виступає як потужний чинник антропогенної адаптивної еволюції.
У біотехнології, генетичної та клітинної інженерії перспективні перспективи. З появою нових і нових векторів людина з їх допомогою впроваджуватиме потрібні гени в клітини рослин, тварин і людини. Це дозволить поступово позбутися багатьох спадкових хвороб людини, змусити клітини синтезувати необхідні ліки та біологічно активні сполуки, а потім – безпосередньо білки та незамінні амінокислоти, які вживаються в їжу. Використовуючи методи, вже освоєні природою, біотехнологи сподіваються отримувати за допомогою фотосинтезу водень - екологічно чисте паливо майбутнього, електроенергію, перетворювати на аміак атмосферний азот за звичайних умов.
Фізичні та хімічні властивості природних білків часто не задовольняють умов, у яких ці білки будуть використовуватися людиною. Потрібна зміна його первинної структури, яка забезпечить формування білка з іншою, ніж раніше, просторовою структурою та новими фізико-хімічними властивостями, що дозволяють і в інших умовах виконувати властиві природному білку функції. Конструюванням білків займається білкова інженерія.
Ще однією сферою застосування білкової інженерії є створення білків, здатних нейтралізувати речовини та мікроорганізми, які можуть бути використані для хімічних та біологічних атак. Наприклад, ферменти гідролази здатні знешкоджувати як нервово-паралітичні гази, так і пестициди, що використовуються в сільському господарстві. При цьому виробництво, зберігання та використання ферментів не є небезпечним для навколишнього середовища та здоров'я людей.
Для отримання зміненого білка використовують методи комбінаторної хімії і здійснюють спрямований мутагенез - внесення специфічних змін кодуючі послідовності ДНК, що призводять до певних змін в амінокислотних послідовностях. Для ефективного конструювання білка із заданими властивостями необхідно знати закономірності формування просторової структури білка, від якої залежать його фізико-хімічні властивості та функції, тобто необхідно знати, як первинна структура білка, кожен його амінокислотний залишок впливає на властивості та функції білка. На жаль, більшість білків невідома третинна структура, який завжди буває відомо, яку саме амінокислоту чи послідовність амінокислот потрібно змінити, щоб отримати білок з потрібними властивостями. Вже зараз вчені з допомогою комп'ютерного аналізу можуть прогнозувати властивості багатьох білків, з послідовності їх амінокислотних залишків. Подібний аналіз спростить процедуру створення потрібних білків. Поки що для того, щоб отримати змінений білок з потрібними властивостями, йдуть переважно іншим шляхом: отримують кілька мутантних генів і знаходять той білковий продукт одного з них, який має потрібні властивості.
Для спрямованого мутагенезу використовують різні експериментальні підходи. Отримавши змінений ген, його вбудовують у генетичну конструкцію та вводять її в прокаріотичні або еукаріотичні клітини, що здійснюють синтез білка, що кодується цією генетичною конструкцією.
I. Білкова інженерія
1 Поняття білкової інженерії. Історія розвитку
Білкова інженерія (англ. Protein engineering) – розділ біотехнології, який займається розробкою корисних чи цінних білків. Це відносно нова дисципліна, яка спрямована на дослідження фолдингу білків та принципів модифікації та створення білків.
Існують дві основні стратегії для білкової інженерії: спрямована модифікація білка та спрямована еволюція. Ці методи є взаємовиключними; дослідники часто застосовують обидва. У майбутньому більш детальне знання структури та функції білків, а також досягнення в галузі високих технологій може значно розширити можливості білкової інженерії. У результаті навіть неприродні амінокислоти можуть бути включені завдяки новому методу, який дозволяє включати нові амінокислоти в генетичний код .
Білкова інженерія зародилася на стику фізики та хімії білка та генетичної інженерії. Вона вирішує завдання створення модифікованих чи гібридних молекул білків із заданими характеристиками. Природним шляхом реалізації такого завдання є передбачення структури гена, що кодує змінений білок, здійснення його синтезу, клонування та експресії у реципієнтних клітинах.
Першу контрольовану модифікацію білка було проведено в середині 60-х років Кошландом і Бендером. Для заміни гідроксильної групи на сульфгідрильну в активному центрі протеази - субтилізину вони застосували метод хімічної модифікації. Однак, як з'ясувалося, такий тіолсубтилізин не зберігає протеазної активності.
Білок у хімічному відношенні є однотипною молекулою, яка є поліамінокислотним ланцюжком або полімером. Складено він із амінокислотних послідовностей 20 типів. Дізнавшись будову білків, люди запитали: чи можна спроектувати абсолютно нові амінокислотні послідовності, щоб вони виконували потрібні людині функції набагато краще, ніж звичайні білки? Для цієї ідеї підійшла назва Білкова інженерія.
Про таку інженерію почали замислюватися ще у 50-ті роки XX століття. Сталося це відразу після розшифрування перших білкових амінокислотних послідовностей. У багатьох лабораторіях світу почали робити спроби дублювати природу та синтезувати хімічним шляхом задані абсолютно довільно поліамінокислотні послідовності.
Найбільше в цьому досяг успіху хімік Б. Мерріфілд. Цьому американцеві вдалося розробити надзвичайно ефективний метод синтезу поліамінокислотних ланцюгів. За це Мерріфілду в 1984 році присудили Нобелівську премію з хімії.
Малюнок 1. Схема функціонування білкової інженерії
Американець почав синтезувати короткі пептиди, включаючи гормони. При цьому побудував автомат - «хімічного робота» - завдання якого входило виробляє штучні білки. Робот викликав сенсацію у наукових колах. Однак незабаром з'ясувалося, що його продукція не може конкурувати з тим, що виробляє природа.
Робот не міг точно відтворювати амінокислотні послідовності, тобто помилявся. Він синтезував один ланцюг з однією послідовністю, а інший уже з трохи зміненим. У клітці всі молекули одного білка ідеально схожі одна на одну, тобто їх послідовності абсолютно однакові.
Була й інша проблема. Навіть ті молекули, які робот синтезував правильно, не набували тієї просторової форми, яка необхідна для функціонування ферменту. Таким чином, спроба підмінити природу звичайними методами органічної хімії призвела до скромного успіху.
Вченим залишалося навчатися у природи, шукаючи необхідні модифікації білків. Тут у тому, що у природі завжди йдуть мутації, які ведуть зміни амінокислотних послідовностей білків. Якщо відібрати мутантів з необхідними властивостями, які більш ефективно переробляють той чи інший субстрат, то можна виділити з такого мутанта змінений фермент, завдяки якому клітина набуває нових властивостей. Але цей процес займає дуже великий період.
Все змінилося тоді, коли виникла генна інженерія. Завдяки їй стали створювати штучні гени з будь-якою послідовністю нуклеотидів. Ці гени вбудовували в приготовлені молекули-вектори та впроваджували ці ДНК у бактерії чи дріжджі. Там із штучного гена знімалася копія РНК. Внаслідок цього вироблявся потрібний білок. Помилки у його синтезі виключалися. Головне, треба було підібрати потрібну послідовність ДНК, а далі вже ферментна система клітини сама бездоганно робила свою справу. Таким чином, можна зробити висновок, що генна інженерія відкрила шлях білкової інженерії в найрадикальнішій формі.
1.2 Стратегії білкової інженерії
Спрямована модифікація білка. При спрямованій модифікації білка вчений використовує детальне знання структури та функції білка, щоб зробити потрібні зміни. Як правило, цей метод має ту перевагу, що він недорогий і технічно нескладний, тому що техніка сайт-спрямованого мутагенезу добре розвинена. Однак, його основним недоліком є те, що відомості про докладну структуру білка часто відсутні, і навіть коли структура відома, може бути дуже важко передбачити вплив різних мутацій.
Програмні алгоритми модифікації білка прагнуть виявлення нових амінокислотних послідовностей, які вимагають мало енергії для формування зумовленої цільової структури. У той час як послідовність, яка має бути знайдена, велика, найбільш складною вимогою для модифікації білка є швидкий, але точний спосіб для виявлення та визначення оптимальної послідовності, на відміну її від аналогічних субоптимальних послідовностей .
Спрямована еволюція. У спрямованій еволюції довільний мутагенез застосовується до білка і селекція йде так, щоб вибрати варіанти, які мають певні якості. Далі застосовуються ще раунди мутації та селекції. Цей метод імітує природну еволюцію і дозволяє отримати чудові результати для спрямованої модифікації.
Додатковий метод, відомий як ДНК-перетасовування, змішує та виявляє частини вдалих варіантів для отримання кращих результатів. Цей процес імітує рекомбінації, що відбуваються природно під час статевого розмноження. Перевагою спрямованої еволюції є те, що вона не вимагає попередніх знань про структуру білка, та й не потрібно, щоб прогнозувати, який вплив дана мутація матиме. Насправді результати експериментів спрямованої еволюції дивують, оскільки бажані зміни часто бувають викликані мутаціями, які не повинні були мати такий ефект. Недоліком є те, що цей метод вимагає високої пропускної здатності, який не є можливим для всіх білків. Велика кількість рекомбінантної ДНК повинна бути мутована і необхідно провести скринінг продуктів на виявлення бажаної якості. Величезна кількість варіантів часто вимагає покупки робототехніки для автоматизації процесу. Крім того, не завжди легко провести скринінг на виявлення всіх цікавих якостей.
ІІ. Приклади інженерних білків
Білкова інженерія може бути заснована на хімічній модифікації готового білка або методах генетичної інженерії, що дозволяють отримувати модифіковані варіанти природних білків.
Конструювання певного біологічного каталізатора ведеться з урахуванням як специфічності білка, і каталітичної активності металоорганічного комплексу. Ось приклади такої модифікації, проведеної для отримання напівсинтетичних біоорганічних комплексів. Міоглобін кашалоту здатний зв'язувати кисень, але не має біокаталітичної активності. В результаті об'єднання цієї біомолекули з трьома електрон-переносними комплексами, що містять рутенії, які зв'язуються з залишками гістидину на поверхні молекул білка, утворюється комплекс, здатний відновлювати кисень при одночасному окисленні ряду органічних субстратів, наприклад аскорбату, зі швидкістю майже такою ж, як для природної аскорбатоксидази. У принципі, білки можна модифікувати й іншими способами. Розглянемо, наприклад, папаїн. Він належить до добре вивчених протеолітичних ферментів, для якого визначено тривимірну структуру. Поблизу залишку цистеїну-25 на поверхні білкової молекули розташовується протяжний жолобок, в якому протікає реакція протеолізу. Ця ділянка може бути алкільована похідним флавіна без зміни доступності ділянки зв'язування потенційних субстратів. Такі модифіковані флавопапаїни використовувалися для окислення М-алкіл-1,4-дигідронікотінамідів, і каталітична активність деяких з цих модифікованих білків була суттєво вищою, ніж у природних флавопротеїн-NADH-дегідрогеназ. У такий спосіб вдалося створити дуже ефективний напівсинтетичний фермент. Використання флавінів з високоактивними, які знаходяться у певному положенні електрон-відтягуючими заступниками, можливо дозволить розробити ефективні каталізатори для відновлення нікотин-аміду.
Великі успіхи, досягнуті останнім часом у хімічному синтезі ДНК, відкрили перед білковою інженерією принципово нові можливості: конструювання унікальних білків, що не зустрічаються в природі. Для цього необхідний і подальший розвиток технології, так щоб зміна генів методами генетичної інженерії призводила до передбачуваних змін білків, до поліпшення цілком певних функціональних характеристик: числа оборотів, Км для конкретного субстрату, термостабільності, температурного оптимуму, стабільності та активності в неводних розчинниках, субстратній та реакційної специфічності, потреби в кофакторах, оптимумі рН, стійкості до протеаз, алостеричної регуляції, молекулярної маси та субодиничної будови. Зазвичай такого поліпшення досягали за допомогою мутагенезу та відбору, а останнім часом – шляхом хімічної модифікації та іммобілізації. Для успішного конструювання конкретного типу молекул білка необхідно виявити ряд основних закономірностей, що пов'язують структурні особливості білків та їх бажані властивості. Так, знаючи точну кристалічну структуру молекули білка, що вивчається, можна ідентифікувати ті її ділянки, які слід спрямовано модифікувати для збільшення його каталітичної активності. Така модифікація може полягати у зміні амінокислотної послідовності білка.
Ще одним прикладом може бути здійснення сайт-специфічного мутагенезу. Він відбувається в такий спосіб. Клонують ген того білка, який цікавить дослідника, і вбудовують його у відповідний генетичний носій. Потім синтезують олігонуклеотидну затравку з бажаною мутацією, послідовність якої з десяти - п'ятнадцяти нуклеотидів достатньо гомологічна певному ділянці природного гена і тому здатна утворювати з ним гібридну структуру. Ця синтетична затравка використовується полімераз для початку синтезу комплементарної копії вектора, яку потім відокремлюють від оригіналу і використовують для контрольованого синтезу мутантного білка. Альтернативний підхід заснований на розщепленні ланцюга, видаленні сайту, що підлягає зміні, і заміщенні його синтетичним аналогом з бажаною послідовністю нуклеотидів.
Тирозил-тРНК-синтетаза каталізує реакцію аміноацилювання тирозинової тРНК, яка включає активування тирозину за допомогою АТР з утворенням тирозиладенілату. Ген цього ферменту, виділений з Bacillus stearothermophilus, був вбудований у бактеріофаг М13. Потім каталітичні властивості ферменту, особливо його здатність пов'язувати субстрат, були змінені шляхом сайт-специфічної модифікації. Так, треонін-51 замінили на аланін. Це призвело до дворазового збільшення зв'язування субстрату, мабуть, через неможливість утворення водневого зв'язку між цим залишком та тирозил-аденілатом. При заміні аланіну проліном порушується конфігурація молекули ферменту, але здатність до зв'язування субстрату збільшується у сто разів, оскільки полегшується його взаємодія з гістидином-48. Подібні сайт-специфічні зміни були отримані в р-лактамазі, і зазвичай вони супроводжувалися інактивацією ферменту. Заміна серину-70 на цистеїн призводить до утворення р-тіоллактамази, константа зв'язування у якої не відрізняється від такої для природного ферменту, але активність по відношенню до пеніциліну становить лише 1-2%. Проте активність цього мутантного ферменту щодо деяких активованих цефалоспоринів не менша від початкової активності або навіть перевищує її; ці білки також стійкіші до дії протеаз.
Мутації, що викликаються шляхом сайт-специфічного впливу, використовують сьогодні для перевірки адекватності результатів структурних досліджень. У деяких випадках з їх допомогою вдалося показати, що структурна стабільність білка та його каталітична активність можуть бути роз'єднані. Нагромадилася достатня кількість інформації про взаємозв'язок між стабільністю структури білка та його функцією, ми, можливо, зуміємо здійснювати тонке регулювання активності біологічних каталізаторів і створювати повністю синтетичні їх аналоги. Нещодавно з'явилася робота, в якій повідомлялося про клонування першого синтетичного гена ферменту, що кодує активний фрагмент молекули рибонуклеази.
ІІІ. Застосування білкової інженерії
Нині найпопулярнішою сферою застосування білкової інженерії є зміна каталітичних властивостей ферментів розробки «екологічно дружніх» промислових процесів. З погляду охорони навколишнього середовища ферменти є найбільш прийнятними з усіх каталізаторів, які у промисловості. Це забезпечується здатністю біокаталізаторів розчинятися у воді та повноцінно функціонувати в середовищі з нейтральним рН та при порівняно низьких температурах. Крім того, завдяки їх високій специфічності, в результаті застосування біокаталізаторів утворюється зовсім небагато небажаних побічних продуктів виробництва. Екологічно чисті та енергозберігаючі промислові процеси, що використовують біокаталізатори, вже давно активно впроваджуються хімічною, текстильною, фармацевтичною, целюлозно-паперовою, харчовою, енергетичною та іншими сферами сучасної промисловості.
Однак деякі характеристики біокаталізаторів роблять їх використання у ряді випадків неприйнятним. Наприклад, більшість ферментів розпадається у разі підвищення температури. Вчені намагаються подолати подібні перешкоди та збільшити стабільність ферментів у суворих умовах виробництва за допомогою методів білкової інженерії.
Крім промислового застосування, білкова інженерія знайшла собі гідне місце у медичних розробках. Дослідники синтезують білки, здатні зв'язуватися з вірусами та мутантними генами, що викликають пухлини, та знешкоджувати їх; створюють високоефективні вакцини та вивчають білки-рецептори клітинної поверхні, які часто є мішенями для фармацевтичних препаратів. Вчені, які займаються вдосконаленням продуктів харчування, використовують білкову інженерію для покращення якостей білків, що забезпечують збереження продуктів рослинного походження, а також желюючих речовин або загусників.
Ще однією сферою застосування білкової інженерії є створення білків, здатних нейтралізувати речовини та мікроорганізми, які можуть бути використані для хімічних та біологічних атак. Наприклад, ферменти гідролази здатні знешкоджувати як нервово-паралітичні гази, так і пестициди, що використовуються в сільському господарстві. При цьому виробництво, зберігання та використання ферментів не є небезпечним для навколишнього середовища та здоров'я людей.
3.1 Бібліотеки пептидів та епітопів
У живому організмі більшість біологічних процесів управляється за допомогою специфічних білок-білкових або білково-нуклеїнових взаємодій. До таких процесів відносяться, наприклад, регуляція транскрипції генів під дією різних білкових факторів, взаємодія білкових лігандів з рецепторами на поверхні клітин, а також специфічне зв'язування антигенів відповідними антитілами. Розуміння молекулярних механізмів взаємодії білкових лігандів з рецепторами має велике фундаментальне та прикладне значення. Зокрема, розробка нових лікарських препаратів білкової природи зазвичай починається з ідентифікації вихідної послідовності амінокислот, що має необхідну біологічну активність (так звана "основна" (lead) послідовність). Однак пептиди з основною послідовністю амінокислот можуть мати і небажані біологічні властивості: низьку активність, токсичність, малу стабільність в організмі і т.п.
До появи бібліотек пептидів поліпшення їх біологічних властивостей здійснювали шляхом послідовного синтезу великої кількості аналогів та перевіркою їхньої біологічної активності, що вимагало великих витрат часу та засобів. Останніми роками з'явилася можливість з допомогою автоматичних синтезаторів створювати протягом короткого часу тисячі різних пептидів. Розроблені методи спрямованого мутагенезу також дозволили різко розширити кількість білків, одержуваних одночасно і тестуються послідовно на біологічну активність. Однак тільки недавно розроблені підходи до створення бібліотек пептидів призвели до отримання мільйонів послідовностей амінокислот, необхідних для проведення ефективного скринінгу з метою виявлення серед них пептидів, що максимально задовольняють критеріям, що висуваються. Такі бібліотеки використовуються для дослідження взаємодії антитіл з антигенами, отримання нових інгібіторів ферментів та антимікробних агентів, конструювання молекул, що мають необхідну біологічну активність, або надання нових властивостей білкам, наприклад антитілам.
За способами одержання бібліотеки пептидів поділяються на три групи. До першої групи можна віднести бібліотеки, одержані з використанням хімічного синтезу пептидів, у яких індивідуальні пептиди іммобілізовані на мікроносіях. При такому підході після приєднання чергових амінокислот в індивідуальних реакційних сумішах до пептидів, іммобілізованим на мікроносіях, вміст всіх реакційних сумішей об'єднують і поділяють на нові порції, які використовують на наступній стадії приєднання нових амінокислотних залишків. Після проведення низки таких етапів виявляються синтезованими пептиди, що містять послідовності використаних у синтезі амінокислот у різних випадкових поєднаннях.
Бібліотеки пептидів, іммобілізованих на мікроносіях, мають істотний недолік: вони вимагають при скринінгу використання очищених рецепторів, що знаходяться в розчинній формі. У той же час у більшості випадків при біологічних випробуваннях, що проводяться для фундаментальних та фармакологічних досліджень, найчастіше знаходять застосування рецептори, асоційовані з мембранами. За другим способом бібліотеки пептидів отримують за допомогою твердофазного синтезу пептидів, при якому на кожній стадії хімічного приєднання чергової амінокислоти до пептидних ланцюгів, що ростуть, використовують еквімолярні суміші всіх або деяких амінокислот-попередників. На кінцевій стадії синтезу проводять відокремлення пептидів від носія, тобто. переведення їх у розчинну форму. Третій підхід до конструювання бібліотек пептидів, до опису якого ми зараз переходимо, став реальним завдяки розвитку методів генної інженерії. Він чудово ілюструє можливості таких методів і, безперечно, є великим досягненням у їх застосуванні. У зв'язку з цим розглянемо докладніше результати використання бібліотек пептидів у дослідженні епітопів (антигенних детермінант) білків.
Генно-інженерна технологія отримання гібридних білків дозволила розробити ефективний метод напрацювання коротких пептидів для аналізу їхньої біологічної активності. Як і у випадку клонотек генів, бібліотеки пептидів, отримані генно-інженерними методами, є великим (часто вичерпним) набором коротких пептидів. Два недавно зроблені спостереження дозволяють розглядати бібліотеку пептидів одночасно і як бібліотеку епітопів білків. По-перше, короткі пептиди можуть включати всі основні залишки амінокислот, які відіграють головну роль у взаємодії з антитілами, і вони можуть імітувати великі антигенні детермінанти білків. По-друге, у більшості випадків нековалентні зв'язки, що утворюються між небагатьма найбільш важливими залишками амінокислот білкових лігандів та їх рецепторами, роблять основний внесок у загальну енергію взаємодії ліганд-рецептор. З огляду на це будь-який пептид можна розглядати як потенційний ліганд, гаптен або частину антигенної детермінанти більших поліпептидів, а будь-яку бібліотеку пептидів - як бібліотеку епітопів білків або потенційних лігандів для відповідних білкових рецепторів.
Бібліотека пептидів, отримана в результаті реалізації третього підходу, в сучасному вигляді являє собою набір десятків або навіть сотень мільйонів коротких послідовностей, що різняться, амінокислот, які експресовані на поверхні віріонів бактеріофагів у складі їх власних структурних білків. Це стає можливим завдяки введенню методами генної інженерії геном бактеріофагів гібридних рекомбінантних генів, що кодують змінені структурні білки його віріонів. (Цей метод відомий під назвою фагового дисплея.) В результаті експресії таких генів утворюються гібридні білки, на N або С-кінцях яких присутні додаткові послідовності амінокислот.
Бібліотеки пептидів та епітопів знайдуть своє застосування і у дослідженнях механізмів гуморальної імунної відповіді, а також захворювань імунної системи. Зокрема, більшість аутоімунних захворювань супроводжується утворенням аутоантитіл проти антигенів власного організму. Ці антитіла в багатьох випадках є специфічними маркерами того чи іншого аутоімунного захворювання. З використанням бібліотеки епітопів, в принципі, можна отримати пептидні маркери, за допомогою яких можна було б стежити за специфічністю аутоантитіл під час розвитку патологічного процесу як в індивідуальному організмі, так і в групі пацієнтів і, крім того, визначати специфічність аутоантитіл при захворюваннях невідомої етіології .
Бібліотеки пептидів та епітопів потенційно можуть бути використані також для скринінгу імунних сироваток з метою виявлення пептидів, що специфічно взаємодіють із захисними антитілами. Такі пептиди імітуватимуть антигенні детермінанти патогенних організмів та слугуватимуть мішенями для захисних антитіл організму. Це дозволить використовувати подібні пептиди для вакцинації пацієнтів, які не мають антитіла проти відповідних патогенів. Вивчення епітопів за допомогою бібліотек пептидів є окремим випадком одного з численних напрямів їх використання у прикладних та фундаментальних дослідженнях взаємодії лігандів та рецепторів. Подальше удосконалення цього підходу має сприяти створенню нових лікарських препаратів на основі коротких пептидів та бути корисним у фундаментальних дослідженнях механізмів білок-білкових взаємодій.
3.2 Білки-репортери у гібридних білках
В іншому випадку гібридні білки застосовують для отримання високого рівня експресії коротких пептидів у бактеріальних клітинах завдяки стабілізації цих пептидів у складі гібридних білків. Часто гібридні білки використовують для ідентифікації та очищення важковизначуваних рекомбінантних білків. Наприклад, приєднавши до С-кінця досліджуваного білка як білка-репортера галактозидазу, можна проводити очищення рекомбінантного білка за активністю галактозидази, визначаючи її антигенні детермінанти імунохімічними методами. Поєднуючи фрагменти ДНК, що містять відкриті рамки зчитування (ОРС), з генами білків-репортерів, можна очистити такі гібридні білки за активністю білка-репортера та використовувати їх для імунізації лабораторних тварин. Отримані антитіла далі застосовують для очищення нативного білка, до складу якого входить рекомбінантний поліпептид, що кодується ОРС, і цим ідентифікують клонований фрагмент гена .
За допомогою гібридних білків вирішують і обернену задачу клонування невідомого гена, до білкового продукту якого є антитіла. У такому випадку конструюють клонотеку послідовностей нуклеотидів, що представляють ОРС невідомих генів, у векторах, які дозволяють з'єднувати ОРС, що клонується, в одній рамці зчитування з геном-репортером. Гібридні білки, що утворюються в результаті експресії цих рекомбінантних генів, ідентифікуються за допомогою антитіл імуноферментними методами. Гібридні гени, що поєднують секретовані білки і білки-репортери, дають можливість по-новому досліджувати механізми секреції, а також локалізацію і переміщення в тканинах білків, що секретуються.
3.3 Деякі досягнення білкової інженерії
Замінивши кілька амінокислотних залишків лізоциму бактеріофага Т4 на цистеїн отримано фермент з великою кількістю дисульфідних зв'язків, завдяки чому цей фермент зберіг свою активність за більш високої температури.
Заміна залишку цистеїну на залишок серину в молекулі р-інтерферону людини, що синтезується кишковою паличкою, запобігала утворенню міжмолекулярних комплексів, при якому приблизно в 10 разів зменшувалася противірусна активність цього лікарського засобу.
Заміна залишку треоніну на залишок проліну в молекулі ферменту тирозил-тРНК-синтетази підвищило каталітичну активність цього ферменту в десятки разів: він став швидше приєднувати тирозин до тРНК, що переносить цю амінокислоту рибосому в ході трансляції.
Субтилізини - багаті на серин ферменти, що розщеплюють білки. Вони секретуються багатьма бактеріями та широко використовуються людиною для біодеградації. Вони міцно пов'язують атоми кальцію, що підвищують їхню стабільність. Однак у промислових процесах присутні хімічні сполуки, які зв'язують кальцій, після чого субтилізини втрачають свою активність. Змінивши ген, вчені видалили з ферменту амінокислоти, що беруть участь у зв'язуванні кальцію, та замінили одну амінокислоту на іншу з метою підвищення стабільності субтилізину. Змінений фермент виявився стабільним та функціонально активним в умовах, близьких до промислових.
Була показана можливість створення ферменту, що функціонує на кшталт рестриктаз, що розщеплюють ДНК у строго визначених місцях. Вчені створили гібридний білок, один фрагмент якого дізнавався певну послідовність нуклеотидних залишків у молекулі ДНК, а інший розщеплював ДНК у цій ділянці.
Активатор тканинного плазміногену – фермент, який використовують у клініці для розчинення згустків крові. На жаль, він швидко виводиться із системи кровообігу та його доводиться вводити повторно або у великих дозах, що призводить до побічних ефектів. Внісши три спрямовані мутації в ген цього ферменту, отримали довгоживучий фермент, що володіє підвищеною спорідненістю до фібрину, що руйнується, і з такою ж фібринолітичною активністю, як у вихідного ферменту.
Зробивши заміну однієї амінокислоти в молекулі інсуліну, вчені домоглися того, що при підшкірному введенні цього гормону хворим, які страждають на діабет, зміна концентрації цього гормону в крові була близько до фізіологічного, що виникає після їди.
Існує три класи інтерферонів, які мають противірусну та протиракову активність, але виявляють різну специфічність. Заманливо було створити гібридний інтерферон, що має властивості інтерферонів трьох типів. Були створені гібридні гени, що включають фрагменти природних генів інтерферонів декількох типів. Частина цих генів, будучи вбудованими в бактеріальні клітини, забезпечували синтез гібридних інтерферонів із більшою, ніж у батьківських молекул, протираковою активністю.
Природний гормон росту людини пов'язується не тільки з рецептором цього гормону, але і з рецептором іншого гормону – пролактину. Щоб уникнути небажаних побічних ефектів у процесі лікування, вчені вирішили усунути можливість приєднання гормону росту до пролактинового рецептора. Вони досягли цього, замінивши деякі амінокислоти в первинній структурі гормону росту за допомогою генетичної інженерії.
Розробляючи засоби проти ВІЛ-інфекції, вчені отримали гібридний білок, один фрагмент якого забезпечував специфічне зв'язування цього білка тільки з ураженими вірусом лімфоцитами, інший фрагмент здійснював проникнення гібридного білка всередину ураженої клітини, а ще один фрагмент порушував синтез білка в ураженій клітині її загибелі.
Білки є основною метою для лікарських засобів. Наразі відомо близько 500 мішеней для дії ліків. У найближчі роки їх кількість зросте до 10 000, що дозволить створити нові, ефективніші та безпечніші ліки. Останнім часом розробляються принципово нові підходи пошуку лікарських засобів: як мішені розглядаються не одиночні білки, а їх комплекси, білок-білкові взаємодії та фолдинг білків.
Висновок
Технологія білкової інженерії використовується (часто - у поєднанні з методом рекомбінантних ДНК) для поліпшення властивостей існуючих білків (ферментів, антитіл, клітинних рецепторів) і створення нових протеїнів, що не існують у природі. Такі білки застосовуються для створення лікарських препаратів, при обробці харчових продуктів та у промисловому виробництві.
Нині найпопулярнішою сферою застосування білкової інженерії є зміна каталітичних властивостей ферментів розробки «екологічно дружніх» промислових процесів. З погляду охорони навколишнього середовища ферменти є найбільш прийнятними з усіх каталізаторів, які у промисловості. Це забезпечується здатністю біокаталізаторів розчинятися у воді та повноцінно функціонувати в середовищі з нейтральним рН та при порівняно низьких температурах. Крім того, завдяки їх високій специфічності, в результаті застосування біокаталізаторів утворюється зовсім небагато небажаних побічних продуктів виробництва. Екологічно чисті та енергозберігаючі промислові процеси, що використовують біокаталізатори, вже давно активно впроваджуються хімічною, текстильною, фармацевтичною, целюлозно-паперовою, харчовою, енергетичною та іншими сферами сучасної промисловості.
Однак деякі характеристики біокаталізаторів роблять їх використання у ряді випадків неприйнятним. Наприклад, більшість ферментів розпадається у разі підвищення температури. Вчені намагаються подолати подібні перешкоди та збільшити стабільність ферментів у суворих умовах виробництва за допомогою методів білкової інженерії.
Крім промислового застосування, білкова інженерія знайшла собі гідне місце у медичних розробках. Дослідники синтезують білки, здатні зв'язуватися з вірусами та мутантними генами, що викликають пухлини, та знешкоджувати їх; створюють високоефективні вакцини та вивчають білки-рецептори клітинної поверхні, які часто є мішенями для фармацевтичних препаратів. Вчені, які займаються вдосконаленням продуктів харчування, використовують білкову інженерію для покращення якостей білків, що забезпечують збереження продуктів рослинного походження, а також желюючих речовин або загусників.
Ще однією сферою застосування білкової інженерії є створення білків, здатних нейтралізувати речовини та мікроорганізми, які можуть бути використані для хімічних та біологічних атак. Наприклад, ферменти гідролази здатні знешкоджувати як нервово-паралітичні гази, так і пестициди, що використовуються в сільському господарстві. При цьому виробництво, зберігання та використання ферментів не є небезпечним для навколишнього середовища та здоров'я людей.
білок інженерія модифікований мутагенез
Список літератури
1.Білкова інженерія.
2.Білкова інженерія. Загадки генетики. / В'ячеслав Маркін // Таємниці, загадки, факти.
Білкова інженерія. //Велика Російська енциклопедія.
Білкова інженерія. // Довідник хіміка 21.
Білкова інженерія та ефективність ліків.
Білкова інженерія. / А.І. Корнелюк//Biopolymers and Cell.
Білкова інженерія підвищить ефективність ліків. // Популярна механіка.
Білкова інженерія. Одержання інсуліну. // Біофайл – науково-інформаційний журнал.
Біотехнологія. Основні напрямки та досягнення. // Біологія для абітурієнтів та вчителів.
Богданов А.А., Медніков Б.М. Влада над геном/А. А. Богданов, Б.М. Медніков - М.: Просвітництво, 1989 - с.208
Генна інженерія. // Здоров'я.
Гени та хіміки. // Генетика.
13. Глік Б., Пастернак Дж. Молекулярна біотехнологія. Принципи та застосування / Б. Глік, Дж. Пастернак. - М: Світ, 2002.
14.Інші галузі застосування генної інженерії. / Л.В. Тимощенка, М.В. Чубик // Медицина - новини та технології.
15. Єгорова Т.А., Клунова С.М., Живухін Є.А. Основи біотехнології. / Т.А. Єгорова, С.М. Клунова, Є.А. Живухін – М., 2003.
16. Інженерія білка. // Хімія та біотехнологія.
17. Патрушев Л.І. Експресія генів/Л.І. Патрушев – М.: Наука, 2000. – 496с.
Патрушев Л.І. Штучні генетичні системи. Т. 1: Генна та білкова інженерія. / Л.І. Патрушев – М.: Наука, 2004. – 526 с.
Рибчин В.М. Основи генетичної інженерії: Підручник для вузів/В.М. Рибчин - СПб.: Вид-во СПбДТУ, 2002. - 522 с.
Степанов В.М. Молекулярна біологія Структури та функції білків. / В.М. Степанов – М.: Вища Школа, 1996.
Технології біотехнології: білкова інженерія, нанобіотехнологія, біосенсори та біочіпи. / Євгенія Рябцева // «Комерційна біотехнологія» – інтернет-журнал.
Чернавський Д.С., Чернавська Н.М. Білок-машина. Біологічні макромолекулярні конструкції. / Д.С. Чернавський, Н. М. Чернавська - М: Вид-во МДУ, 1999.
Шульц Г.Є., Ширмер Р.Х. Принципи структурної організації білків. / Г.Є. Шульц, Р.Х. Ширмер – М.: Світ, 1982.
24. Brannigan J.А., Wilkinson А.J. Protein engineering 20 years on // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. № 12;
25.Protein engineering. // Wikipedia, free encyclopedia.
Після розгляду способів отримання сайт-специфічних мутацій необхідно зробити лише один крок, щоб виявитися віч-на-віч з бурхливим напрямом молекулярної генетики, званим білковою інженерією. Справді, розробка методів спрямованого мутагенезу дала можливість як з високою точністю модифікувати окремі білки й вивчати їх структурно-функциональные взаємовідносини, а й конструювати нові білки, які у природі. Вражаючими результатами застосування такого підходу є гібридні білки, одержувані шляхом поєднання фрагментів та функціональних доменів різних поліпептидних ланцюгів з використанням генно-інженерних методів.
Інший перспективний напрямок білкової інженерії – це конструювання біологічно активних пептидів, що мають фармакологічну активність.
Бібліотеки пептидів та епітопів
У живому організмі більшість біологічних процесів управляється за допомогою специфічних білок-білкових або білково-нуклеїнових взаємодій. До таких процесів відносяться, наприклад, регуляція транскрипції генів під дією різних білкових факторів, взаємодія білкових лігандів з рецепторами на поверхні клітин, а також специфічне зв'язування антигенів відповідними антитілами. Розуміння молекулярних механізмів взаємодії білкових лігандів з рецепторами має велике фундаментальне та прикладне значення. Зокрема, розробка нових лікарських препаратів білкової природи зазвичай починається з ідентифікації вихідної послідовності амінокислот, що має необхідну біологічну активність (так звана "основна" (lead) послідовність). Однак пептиди з основною послідовністю амінокислот можуть мати і небажані біологічні властивості: низьку активність, токсичність, малу стабільність в організмі і т.п.
До появи бібліотек пептидів поліпшення їх біологічних властивостей здійснювали шляхом послідовного синтезу великої кількості аналогів та перевіркою їхньої біологічної активності, що вимагало великих витрат часу та засобів. Останніми роками з'явилася можливість з допомогою автоматичних синтезаторів створювати протягом короткого часу тисячі різних пептидів. Розроблені методи спрямованого мутагенезу також дозволили різко розширити кількість білків, одержуваних одночасно і тестуються послідовно на біологічну активність. Однак тільки недавно розроблені підходи до створення бібліотек пептидів призвели до отримання мільйонів послідовностей амінокислот, необхідних для проведення ефективного скринінгу з метою виявлення серед них пептидів, що максимально задовольняють критеріям, що висуваються. Такі бібліотеки використовуються для дослідження взаємодії антитіл з антигенами, отримання нових інгібіторів ферментів та антимікробних агентів, конструювання молекул, що мають необхідну біологічну активність, або надання нових властивостей білкам, наприклад антитілам.
За способами одержання бібліотеки пептидів поділяються на три групи. До першої групи можна віднести бібліотеки, одержані з використанням хімічного синтезу пептидів, у яких індивідуальні пептиди іммобілізовані на мікроносіях. При такому підході після приєднання чергових амінокислот в індивідуальних реакційних сумішах до пептидів, іммобілізованим на мікроносіях, вміст всіх реакційних сумішей об'єднують і поділяють на нові порції, які використовують на наступній стадії приєднання нових амінокислотних залишків. Після проведення низки таких етапів виявляються синтезованими пептиди, що містять послідовності використаних у синтезі амінокислот у різних випадкових поєднаннях.
Бібліотеки пептидів, іммобілізованих на мікроносіях, мають істотний недолік: вони вимагають при скринінгу використання очищених рецепторів, що знаходяться в розчинній формі. У той же час у більшості випадків при біологічних випробуваннях, що проводяться для фундаментальних та фармакологічних досліджень, найчастіше знаходять застосування рецептори, асоційовані з мембранами. За другим способом бібліотеки пептидів отримують за допомогою твердофазного синтезу пептидів, при якому на кожній стадії хімічного приєднання чергової амінокислоти до пептидних ланцюгів, що ростуть, використовують еквімолярні суміші всіх або деяких амінокислот-попередників. На кінцевій стадії синтезу проводять відокремлення пептидів від носія, тобто. переведення їх у розчинну форму. Третій підхід до конструювання бібліотек пептидів, до опису якого ми зараз переходимо, став реальним завдяки розвитку методів генної інженерії. Він чудово ілюструє можливості таких методів і, безперечно, є великим досягненням у їх застосуванні. У зв'язку з цим розглянемо докладніше результати використання бібліотек пептидів у дослідженні епітопів(антигенний детермінант) білків.
Генно-інженерна технологія отримання гібридних білків дозволила розробити ефективний метод напрацювання коротких пептидів для аналізу їхньої біологічної активності. Як і у випадку клонотек генів, бібліотеки пептидів, отримані генно-інженерними методами, є великим (часто вичерпним) набором коротких пептидів. Два недавно зроблені спостереження дозволяють розглядати бібліотеку пептидів одночасно і як бібліотеку епітопів білків. По-перше, короткі пептиди можуть включати всі основні залишки амінокислот, які відіграють головну роль у взаємодії з антитілами, і вони можуть імітувати великі антигенні детермінанти білків. По-друге, у більшості випадків нековалентні зв'язки, що утворюються між небагатьма найбільш важливими залишками амінокислот білкових лігандів та їх рецепторами, роблять основний внесок у загальну енергію взаємодії ліганд–рецептор. З огляду на це будь-який пептид можна розглядати як потенційний ліганд, гаптен або частину антигенної детермінанти більших поліпептидів, а будь-яку бібліотеку пептидів – як бібліотеку епітопів білків або потенційних лігандів для відповідних білкових рецепторів.
Мал. ІІ.19. Схема експресії пептидних епітопів на поверхні оболонки ниткоподібних коліфагів.
Пептидні епітопи знаходяться у складі гібридних поліпептидних ланцюгів мінорного білка pIII ( а) або основного білка pVIII вірусної оболонки ( б). Стрілки вказують положення кодують епітопи олігонуклеотидних фрагментів у геномі бактеріофага, а також положення самих епітопів. У складі поліпептиду pIII ( а) показано лише одну копію епітопу (насправді їх кількість досягає 4–5)
Бібліотека пептидів, отримана в результаті реалізації третього підходу, в сучасному вигляді являє собою набір десятків або навіть сотень мільйонів коротких послідовностей, що різняться, амінокислот, які експресовані на поверхні віріонів бактеріофагів у складі їх власних структурних білків. Це стає можливим завдяки введенню методами генної інженерії геном бактеріофагів гібридних рекомбінантних генів, що кодують змінені структурні білки його віріонів. (Цей метод відомий під назвою фагового дисплея.) В результаті експресії таких генів утворюються гібридні білки, на N- або С-кінцях яких (див. нижче) присутні додаткові послідовності амінокислот. У найбільш добре розробленій системі, що дозволяє конструювати бібліотеки пептидів генно-інженерними методами, використовують невеликий ниткоподібний коліфаг f1 і два його білки: основний та мінорний білки оболонки pVIII та pIII. In vivo обидва білки синтезуються у вигляді поліпептидних ланцюгів з короткими N-кінцевими сигнальними послідовностями, які відщеплюються сигнальною пептидазою під час їхнього дозрівання після перенесення до внутрішньої частини бактеріальної мембрани. Зрілі білки вбудовуються в оболонку бактеріофага в процесі її збирання. При цьому білок pVIII утворює основну оболонку бактеріофага, тоді як чотири або п'ять молекул pIII асоційовані з кінцевою частиною віріону та забезпечують взаємодію вірусних частинок із статевими ворсинками клітин E. coli (рис. II.19). Генно-інженерними методами пептиди з'єднують з білками - безпосередньо з їх N-кінцевими послідовностями або на невеликій відстані. Кінцеві послідовності більшості білків є більш гнучкими і, як правило, експонуються на поверхні глобули, що дозволяє одержувати гібридні рекомбінантні білки без суттєвого порушення їх основних властивостей, а також робить інтегровані пептиди доступними для розпізнавання ззовні. Крім того, у такому положенні і просторова структура самих пептидів відчуває менший вплив білка-носія. В ході експериментів було встановлено, що введення чужорідних пептидів в N-кінцеву частину білка pIII не істотно впливає на життєздатність та інфекційність фагових частинок, тоді як з'єднання пептидів довжиною >5 амінокислотних залишків з N-кінцевою частиною білка pVIII порушує складання віріонів. Останнє утруднення можна подолати доставкою до місця збирання віріонів молекул білка pVIII дикого типу, синтез яких спрямовується відповідним геном вірусу-помічника. У цьому випадку оболонка бактеріофага міститиме як змінені білки pVIII, так і поліпептиди дикого типу від вірусу-помічника.
Мал. ІІ.20. Схема конструювання рекомбінантного вірусного геному, що містить вставки вироджених олігонуклеотидів, для отримання бібліотеки епітопів
Дволанцюжковий олігонуклеотид ( а), що містить вироджені кодони NNK і ті ж сайти рестрикції у складі лінкерів, лігують з ДНК вектора Fuse5 ( б), розщепленого рестриктазою Sfi I, з утворенням рекомбінантного геному ( в), який спрямовує синтез гібридного рекомбінантного білка ( г), що містить на N-кінці зазначену амінокислотну послідовність
При конструюванні бібліотеки пептидів насамперед синтезують два комплементарні один одному олігонуклеотиди, які після відпалу утворюють дволанцюжкову молекулу, центральна частина якої кодує власне пептиди (рис. II.20, а), а одноланцюгові ділянки, що виступають по кінцях, комплементарні "липким" кінцям вектора, що виходять під дією відповідної рестриктази (див. рис. II.20, б).
Для кодування амінокислот пептидів використовують вироджені кодони виду NNK або NNS, які включають усі чотири нуклеотиди (N) у першому та другому положеннях, G або T (K), а також G або С (S) у третьому положенні. При такому підході інформація про всі 20 амінокислот і один стоп-кодон міститься в 32 різних кодонах NNK і NNS, а не в 64, як це має місце у випадку природного генетичного коду.
У процесі синтезу вироджених олігонуклеотидів, що кодують досліджувані пептиди, на кожній стадії використовують індивідуальні нуклеотиди для кодонів інваріантних амінокислот, фланкуючих варіабельну ділянку пептиду, а також еквімолярні суміші нуклеотидів для ділянок, що кодують випадкові послідовності. Набір вироджених олігонуклеотидів, що утворився в результаті, далі клонують у вигляді одноланцюгових фрагментів у відповідних сайтах гена білка оболонки бактеріофага у складі фагового вектора або фазміди. Альтернативно для такого набору олігонуклеотидів (хімічно або за допомогою ПЛР) синтезують комплементарні ланцюги з включенням інозину в варіабельні ділянки, оскільки його залишки, як відомо, спаровуються з основами С і T матриці, що полегшує утворення правильних дуплексів між відповідними олігону. Утворені дволанцюжкові олігонуклеотиди у разі потреби обробляють відповідними рестриктазами і клонують у фаговому векторі. Підсумкові рекомбінантні молекули (див. рис. II.20, в) ДНК вводять у бактеріальні клітини, отримуючи ~10 9 трансформантів на 1 мг рекомбінантної ДНК, фагові частинки, що утворилися, розмножують в бактеріях і після очищення досліджують на присутність рекомбінантних пептидів (див. рис. II.20, г), здатних взаємодіяти з досліджуваними рецепторами у білках їх віріонів.
Число індивідуальних фагових клонів у бібліотеці є визначальним для її використання. Наприклад, бібліотека, що містить у собі можливі гексапептиди, повинна містити 64 млн (20 6) різних шестичленних амінокислотних послідовностей, що кодуються ~1 млрд (32 6) різних гексакодонів (32 – число кодонів, за допомогою яких можна закодувати будь-яку з 20 амінокислот запропонованим вище способом, а саме з використанням кодонів (NNK або NNS). Для вирішення такого завдання мають бути отримані дуже великі бібліотеки, що містять, принаймні, 2·10 8 – 3·10 8 індивідуальних, незалежних клонів, а величина 10 9 в даний час є верхньою межею для числа індивідуальних клонів бібліотеки, яку ще можна практично використати.
Виходячи з цього, можна зробити висновок, що максимальна довжина пептидів, що включають всі можливі поєднання 20 амінокислот, з якими можливо працювати за допомогою бібліотек пептидів, становить 6 амінокислотних залишків. Тим не менш, слід мати на увазі, що бібліотека 15-членних пептидів того ж розміру (2-3 · 10 8 клонів) міститиме більше різноманітних гексапептидів, ніж розглянута вище бібліотека 6-членних пептидів. Крім того, оскільки лише обмежена кількість амінокислотних залишків у пептиді дійсно визначає його біологічну активність, бібліотека 15-членних пептидів може виявитися представницькою бібліотеки більш коротких пептидів з тим самим числом клонів.
Мал. ІІ.21. Схема відбору фагових частинок, що володіють необхідними епітопами
Показано три рекомбінантні фагові частинки, що експресують різні епітопи у складі pIII. Тільки епітоп центральної фагової частинки розпізнається молекулою біотинільованого антитіла, іммобілізованого на чашці Петрі за допомогою стрептавидину та використаного для скринінгу бібліотеки.
Для того щоб виділити з бібліотеки пептиди з біологічною активністю, що шукається, застосовують різні методи скринінгу. Зокрема, для виділення пептидів, що імітують певні епітопи, використовують біотиніловані моноклональні антитіла відповідної специфічності, що іммобілізують на твердій підкладці за допомогою стрептавидину (рис. II.21). Фагові частинки, що експресують на своїй поверхні відповідні епітопи, взаємодіють з антитілами і затримуються підкладкою, тоді як інші рекомбінантні фагові частинки видаляються в процесі промивання. Затримані на підкладці фагові частинки далі елююють кислотою, індивідуальні клони додатково розмножують у бактеріальних клітинах та експресовані на них епітопи досліджують за різними критеріями. Наявність ідентичних або подібних послідовностей нуклеотидів серед клонованих послідовностей свідчить про специфічність процесу очищення. Індивідуальні клони потім характеризують іншими, зокрема імуноферментними методами. На заключній стадії дослідження здійснюють синтез виділених пептидів та їхнє всебічне вивчення в очищеному стані.
В даний час є дані про деякі роботи, проведені з використанням пептидних бібліотек. В одному з таких досліджень з бібліотеки були виділені пептиди, послідовність амінокислот у яких різко відрізнялася від послідовності амінокислот істинного епітопу антигену, що досліджується. Тим не менш, такий пептид міцно зв'язувався зі специфічними антитілами та конкурував за зв'язування із природним антигеном. Це дозволило зробити висновок про можливість існування мимотопів- коротких пептидів, що імітують природні епітопи, послідовності амінокислот яких суттєво різняться між собою. Вдалося встановити канонічні послідовності амінокислот пептидів, що імітують епітопи природних білків, а серед них ідентифікувати амінокислотні залишки, які відіграють ключову роль у взаємодії антиген-антитіло.
Одним з багатообіцяючих додатків бібліотек пептидів є ідентифікація пептидних лігандів, що імітують "структурні" епітопи, що утворюються на поверхні білкових глобул в результаті згортання їх поліпептидних ланцюгів, що супроводжується просторовим зближенням амінокислотних залишків, розташованих у поліпептидних залишках. За допомогою пептидних бібліотек можлива ідентифікація аналогів пептидних різних епітопів небілкової природи. Очевидно, найближчим часом можливе використання пептидних бібліотек отримання нових лікарських засобів, створення діагностичних засобів і виробництва ефективних вакцин. В галузі конструювання нових лікарських препаратів зусилля дослідників могли б бути спрямовані на створення пептидних лігандів, які специфічно взаємодіють з рецепторами, що становлять медико-біологічний інтерес. Знання структури таких лігандів дозволило б полегшити отримання на цій основі лікарських препаратів небілкової природи.
Бібліотеки пептидів та епітопів знайдуть своє застосування і у дослідженнях механізмів гуморальної імунної відповіді, а також захворювань імунної системи. Зокрема, більшість аутоімунних захворювань супроводжується утворенням аутоантитіл проти антигенів власного організму. Ці антитіла в багатьох випадках є специфічними маркерами того чи іншого аутоімунного захворювання. З використанням бібліотеки епітопів, в принципі, можна отримати пептидні маркери, за допомогою яких можна було б стежити за специфічністю аутоантитіл під час розвитку патологічного процесу як в індивідуальному організмі, так і в групі пацієнтів і, крім того, визначати специфічність аутоантитіл при захворюваннях невідомої етіології .
Бібліотеки пептидів та епітопів потенційно можуть бути використані також для скринінгу імунних сироваток з метою виявлення пептидів, що специфічно взаємодіють із захисними антитілами. Такі пептиди імітуватимуть антигенні детермінанти патогенних організмів та слугуватимуть мішенями для захисних антитіл організму. Це дозволить використовувати подібні пептиди для вакцинації пацієнтів, які не мають антитіла проти відповідних патогенів. Вивчення епітопів за допомогою бібліотек пептидів є окремим випадком одного з численних напрямів їх використання у прикладних та фундаментальних дослідженнях взаємодії лігандів та рецепторів. Подальше удосконалення цього підходу має сприяти створенню нових лікарських препаратів на основі коротких пептидів та бути корисним у фундаментальних дослідженнях механізмів білок-білкових взаємодій.
У розглянутих вище бібліотеках пептидів останні ковалентно пов'язані із білком-носієм. У такому вигляді вони є одними з представників гібридних білків, які отримують методи генної інженерії.
В іншому випадку гібридні білки застосовують для отримання високого рівня експресії коротких пептидів у бактеріальних клітинах завдяки стабілізації цих пептидів у складі гібридних білків. Часто гібридні білки використовують для ідентифікації та очищення важковизначуваних рекомбінантних білків. Наприклад, приєднавши до С-кінця досліджуваного білка як білка-репортера -галактозидазу, можна проводити очищення рекомбінантного білка за активністю -галактозидази, визначаючи її антигенні детермінанти імунохімічними методами. Поєднуючи фрагменти ДНК, що містять відкриті рамки зчитування (ОРС), з генами білків-репортерів, можна очистити такі гібридні білки за активністю білка-репортера та використовувати їх для імунізації лабораторних тварин. Отримані антитіла далі застосовують для очищення нативного білка, до складу якого входить рекомбінантний поліпептид, що кодується ОРС, і цим ідентифікують клонований фрагмент гена.
За допомогою гібридних білків вирішують і обернену задачу клонування невідомого гена, до білкового продукту якого є антитіла. У такому випадку конструюють клонотеку послідовностей нуклеотидів, що представляють ОРС невідомих генів, у векторах, які дозволяють з'єднувати ОРС, що клонується, в одній рамці зчитування з геном-репортером. Гібридні білки, що утворюються в результаті експресії цих рекомбінантних генів, ідентифікуються за допомогою антитіл імуноферментними методами. Гібридні гени, що поєднують секретовані білки і білки-репортери, дають можливість по-новому досліджувати механізми секреції, а також локалізацію і переміщення в тканинах білків, що секретуються.
Гібридні токсини
Серія робіт І. Пастана із співробітниками з конструювання гібридних токсинів спрямованої дії чудово ілюструє можливості білкової інженерії щодо комбінування різних функціональних доменів білків для досягнення конкретних біологічних ефектів.
Мал. ІІ.22. Лікарські препарати спрямованої дії на основі гібридних токсинів
а- Узагальнена схема структури лікарського препарату спрямованої дії; б- будова псевдомонадного токсину (цифрами позначено положення амінокислотних залишків); в– будова гібридного токсину; г– гібридний токсин на основі моноклональних антитіл
Ідеальний лікарський засіб суворо специфічної виборчої дії повинен мати принаймні наступні структурно-функціональні особливості (рис. II.22, а). Такий лікарський препарат повинен містити діючий початок для досягнення фізіологічного ефекту та ліганд, що розпізнає рецептор на поверхні клітин-мішеней. Крім того, в ньому повинні бути структурні елементи, що розпізнаються системою транспорту організму, для доставки ліків до клітин-мішеней, а також спейсерну ділянку, необхідну відділення діючого початку від інших функціональних частин препарату після його доставки за адресою. Саме така ідеальна схема реалізується у природному екзотоксин Pseudomonas aeruginosa. Екзотоксин А P. aeruginosa являє собою білок, що складається з одного поліпептидного ланцюга довжиною 613 амінокислот, яка організована в три функціональні домени (див. рис. II.22, б). N-Кінцевий домен Ia (амінокислотні залишки 1-252) необхідний для взаємодії з поверхнею клітин-мішеней (прототип ліганду ідеальних ліків спрямованої дії). Функції домену Ib (амінокислотні залишки 365-404) наразі невідомі. Домен II (амінокислотні залишки 253-364) забезпечує ефективне перенесення токсину в цитозоль клітин (система транспорту ліків), а домен III (амінокислотні залишки 405-613) здійснює ADP-рибозилювання фактора елонгації трансляції EF2, що призводить до пригнічення трансляції трансляції мішеней. Таким чином, для надання цитотоксичної дії екзотоксин A необхідно за допомогою домену Iа розпізнати рецептори на поверхні клітин, проникнути в клітину за допомогою ендоцитозу, опосередкованого рецепторами, і бути транслокованим через внутрішню мембрану в цитозоль, де локалізується фактор EF2. Основна ідея у створенні токсинів спрямованої дії полягала в тому, щоб замінити домен Iа на якийсь інший пептидний ліганд, що взаємодіє з іншою групою рецепторів на поверхні клітин, і тим самим змінити специфічність дії токсину щодо самих клітин (див. рис. II. 22, в).
Було встановлено, що видалення домену Iа генно-інженерними методами різко (у сотні та тисячі разів) знижує токсичність такого укороченого білка як щодо клітин різних ліній, так і in vivo. Приєднання до С-кінцевої частини укороченого поліпептиду молекули інтерлейкіну 2 людини здійснювали шляхом об'єднання структурних частин відповідних генів в векторі, що експресує. Очищений гібридний токсин виявився надзвичайно токсичним щодо клітин, що несуть на своїй поверхні рецептори інтерлейкіну 2, і не діяв на клітини, у яких ці рецептори були відсутні та які гинули під дією природного токсину. Інтерналізація(Транслокація всередину клітин) гібридного токсину була опосередкована субодиницями р55 і р70 рецептора інтерлейкіну 2. Таким чином, в результаті дії гібридного токсину на популяцію клітин, частина з яких експресує на своїй поверхні рецептори інтерлейкіну 2 відбувається виборча загибель саме цих клітин.
В організмі більшість спочиваючих T-клітин і T-клітин пам'яті не експресують на своїй поверхні високоафінних рецепторів інтерлейкіну 2, тоді як T-клітини, стимульовані аллоантигенами, містять такі рецептори. Тому внутрішньочеревне введення гібридного токсину щурам із експериментальним артритом – захворюванням, обумовленим патологічною активацією T-клітин, знижувало симптоми захворювання. Гібридний токсин суттєво зменшував у мишей та реакції відторгнення трансплантату.
Слідом за цими піонерськими роботами була ціла серія досліджень, спрямованих на створення аналогічних систем адресної доставки різних цитотоксичних поліпептидів. У процесі подальшого вдосконалення системи адресної доставки псевдомонадного токсину з використанням інтерлейкіну 2 як ліганд відмовилися від повного видалення адресного домену токсину і обмежилися його інактивацією шляхом введення в ген токсину чотирьох сайт-специфічних мутацій. Молекули такого гібридного токсину виявилися в 10-100 разів більш ефективними цитотоксичними агентами проти клітин людини та мавп, що експресують на своїй поверхні рецептори для інтерлейкіну 2, а також мали значно більший час напівжиття в крові мишей in vivo порівняно з раніше отриманою конструкцією.
На основі псевдомонадного токсину були створені гібридні токсини, що містять в якості лігандів поліпептидні ланцюги інтерлейкіну 4, інтерлейкіну 6, трансформуючого фактора росту типу та інсуліноподібного фактора росту I. Для всіх цих гібридних білків була показана високоспецифічна клітина. ), які мають відповідні рецептори. Використання в гібридному токсині в якості ліганду частини поліпептидного ланцюга CD4 – глікопротеїну поверхні T-клітин, який є рецептором вірусу ВІЛ та взаємодіє з його глікопротеїном gp120, дозволило вибірково вражати T-клітини, заражені вірусом ВІЛ та експресують2 на своїй поверхні.
Той самий принцип придушення інфекції, викликаної вірусами ВІЛ, розчинними рецепторами CD4 був використаний при конструюванні гібридних білків, що поєднують частини поліпептидних ланцюгів CD4 з константними частинами важких або легких ланцюгів імуноглобулінів людини. При цьому в процесі об'єднання генів були видалені нуклеотидні послідовності, що кодують трансмембранний і цитоплазматичний домени CD4, а також варіабельну частину поліпептидних ланцюгів імуноглобулінів. Гібридні молекули, що утворюються, названі імуноадгезинами, за рахунок константної частини молекули імуноглобуліну набували підвищеної стабільності в організмі і, крім того, зберігали специфічні властивості, опосередковані константними частинами імуноглобулінів: зв'язування Fс-рецептора та білка A, здатність до фіксації комплементу та перенесення через плацентарний бар'єр. Сукупність усіх цих властивостей давала можливість імуноадгезинам ефективно переривати інфекцію T-клітин вірусом ВІЛ-I, блокуючи як сам вірус, так і заражені ним клітини, що експресують на своїй поверхні вірусний антиген gp120.
Подальше вдосконалення генно-інженерних конструкцій на основі псевдомонадного екзотоксин А сталося після того, як в якості адресної частини гібридного токсину стали використовувати варіабельні домени моноклональних антитіл до компонента p55 рецептора інтерлейкіну 2 людини. У цьому рекомбінантному білку за допомогою 15-ланкового пептидного лінкеру амінокислот з'єднували варіабельний домен важкого ланцюга цього імуноглобуліну з варіабельним доменом його легкого ланцюга, а С-кінець легкого ланцюга - з N-кінцем укороченого псевдомонадного токсину. г). Такі молекули гібридного токсину також виявилися високоспецифічними цитотоксичними агентами стосовно лейкозних клітин людини, що експресують на своїй поверхні рецептори інтерлейкіну 2.
Розроблений підхід продемонстрував можливість використання специфічних антитіл як адресні частини гібридних токсинів. Це дає до рук дослідників універсальний спосіб адресної доставки токсинів, який у майбутньому дозволить надавати цитотоксичну дію будь-які групи клітин, що експресують своєї поверхні специфічні антигени, тобто. значно розширити кількість мішеней для хіміотерапевтичних дій з використанням рекомбінантних білків.
Крім псевдомонадного екзотоксин A як діючого початку в гібридних токсинах успішно застосовували дифтерійний токсин, фактор некрозу пухлин і A-ланцюг рицину. Оскільки A-білок вибірково взаємодіє з константними (Fс) частинами імуноглобулінів класу G багатьох ссавців, такий гібридний токсин у парі з імуноглобуліном, отриманим проти будь-якого антигену на поверхні клітин, вибірково зв'язується з цими клітинами та вбиває їх. Такі імунотоксини є ще одним потенційним протипухлинним агентом і можуть бути використані проти клітин, що експресують на своїй поверхні специфічні антигени.
Мал. ІІ.23. Використання гібридного білка для регуляції експресії гена
Методи генної інженерії відкривають безмежні можливості конструювання нових білків шляхом об'єднання різних комбінаціях різних функціональних доменів поліпептидних ланцюгів. Отримання гібридних токсинів спрямованої дії ілюструє можливості такого підходу до білкової інженерії. Як остання ілюстрація можливостей цієї групи методів розглянемо гібридний білок як новий регулятор активності генів. При конструюванні такого білка методами генної інженерії було замінено ДНК-зв'язуючий домен у рецепторі глюкокортикоїдних гормонів на відповідний домен LexA-репресора E. coli (рис. II.23).
Введення операторної послідовності гена lexAв область промотору глобінового гена (або інших генів) призводило до активації промотора під дією гібридного білка у присутності дексаметазону – синтетичного гормону, що взаємодіє з рецептором глюкокортикоїдів. Таким чином, у новому генетичному оточенні послідовність нуклеотидів оператора гена lexA E. coli функціонувала як енхансер транскрипції в присутності гібридного білка-активатора, що дізнається цю послідовність. Результати роботи демонструють можливість створення нових білків – регуляторів активності генів шляхом поєднання відомих функціональних доменів.
Розвиток білкової інженерії багато в чому стримується недоліком знання структурно-функціональних взаєминах в білках, що з складністю об'єкта дослідження. Численні роботи, створені задля вивчення таких зв'язків, зазвичай, носять емпіричний характері і завершуються локалізацією амінокислот, істотних функціонування активних центрів ферментів. Тому основне завдання білкової інженерії – за відомою послідовністю амінокислотних залишків отримати білок із заданими властивостями – нині ще далека від свого дозволу. Тим не менш, вже зараз іноді вдається цілеспрямовано змінювати деякі властивості існуючих ферментів шляхом замін невеликої кількості амінокислотних залишків поліпептидних ланцюгів за допомогою спрямованого мутагенезу.