Віруси. Взаємодія вірусу з клітиною

Вірусні захворювання виникли в далекій давнині, однак вірусологія як наука почала розвиватися в кінці XIX століття.

У 1892 р російський вчений-ботанік Д. І. Іванівський, вивчаючи мозаїчну хворобу листя тютюну, встановив, що захворювання це викликається дрібними мікроорганізмами, які проходять через дрібнопористі бактеріальні фільтри. Ці мікроорганізми отримали назву фільтруються вірусів (від лат. Virus - отрута). Надалі було показано, що є й інші мікроорганізми, що проходять через бактеріальні фільтри, тому що фільтруються віруси стали називати просто вірусами.

Великий внесок у вивчення вірусів внесли радянські вірусологи: М. А. Морозов, Н. Ф. Гамалія, Л. А. Зільбер, М. П. Чумаков, А. А. Смородинцев, В. М. Жданов та ін.

Віруси - це некліткова форма існування живої матерії. Вони дуже малі. За образним висловом В. М. Жданова "величину їх по відношенню до величини середніх бактерій можна порівняти з величиною миші по відношенню до слону". Побачити віруси стало можливим тільки після винаходу електронного мікроскопа.

В даний час для вивчення вірусів використовують багато методів: хімічні, фізичні, молекулярно-біологічні, імунобіологічні і генетичні.

Всі віруси підрозділяються на вражають людину, тварин, комах, бактерії і рослини.

У вірусів спостерігається велика різноманітність форм і біологічних властивостей, проте всі вони мають загальні риси будови. Зрілі частинки вірусів називають вирионами.

На відміну від інших мікроорганізмів, що містять одночасно ДНК і РНК, віріон містить тільки одну з нуклеїнових кислот - або ДНК, або РНК.

Нуклеїнова кислота вірусів може бути однонитчатим і двунитчатой. Майже всі віруси, що містять РНК, мають в своєму геномі однонитчатим РНК, а містять ДНК - двунитчатую ДНК. Відповідно до двома типами генетичного матеріалу віруси поділяють на РНК і ДНК-містять. До ДНК-відносяться 5 сімейств, РНК-- 10 сімейств.

* (Тут наведені дані, що стосуються тільки деяких з патогенних для людини вірусів.)

структура віріона. У центрі віріона знаходиться нуклеїнова кислота, яка оточена капсидом (від грец. Kanca - ящик). Капсид складається з білкових субодиниць, званих капсомерами. Зрілий вірус за хімічною структурою є нуклеокапсидом. Кількість капсомер і спосіб їх укладання (рис. 52) строго постійні для кожного виду вірусу. Наприклад, вірус поліомієліту містить 32 капсомеров, а аденовірус - 252 капсомеров. Капсомери можуть бути покладені в вигляді багатогранника з рівномірними симетричними гранями - кубоідальная форма (наприклад, аденовірус). Укладання у вигляді спіралей (сферична) характерна для вірусів грипу. Може бути тип симетрії, при якому нуклеїнова кислота має вид пружини, навколо якої покладені капсомери, в цьому випадку вірус має паличкоподібну форму - вірус, що викликає хворобу листя тютюну.

Складний тип симетрії має фаг: головка - кубоідальной, а відросток - паличкоподібні форми (сперматозоідная форма) (див. Рис. 21, 22).

Таким чином, в залежності від способу укладання віруси поділяють на кубоідальную, сферичну, паличкоподібну і сперматозоідную форми.

Деякі віруси, що володіють більш складною структурою, мають оболонку, яка називається пеплос. Вона утворюється при виході вірусу з клітини господаря. Вірусний капсид при цьому обволікається внутрішньою поверхнею мембрани цитоплазми клітини господаря і утворюється один або кілька шарів оболонки суперкапсид. Таку оболонку мають тільки деякі віруси, наприклад віруси сказу, герпесу, енцефаліту. Ця оболонка містить фосфоліпіди, що руйнуються під впливом ефіру. Таким чином, впливаючи ефіром, можна відрізнити вірус, що має пеплос, від вірусу з "голим капсидом".

У деяких вірусів з зовнішнього ліпідного шару оболонки виступають капсомери у вигляді шипів (ці шипи тупі). Такі віруси називаються пепломерамі (наприклад, вірус грипу, див. Рис. 52).

Нуклеїнова кислота вірусу є носієм спадкових властивостей, а капсид і зовнішня оболонка несуть захисні функції, як би оберігаючи нуклеїнових кислот. Крім того, вони сприяють проникненню вірусу в клітину.

розміри вірусів. Вимірюються віруси в нанометрах. Величина їх коливається в широкому діапазоні від 15-20 до 350-400 нм.

Методи вимірювання вірусів: 1) фільтрування через бактеріальні фільтри з відомою величиною пір; 2) ультрацентрифугирование - великі віруси осідають швидше; 3) фотографування вірусів в електронному мікроскопі.

Хімічний склад вірусів. Кількість і зміст ДНК і РНК вірусів неоднакові. У ДНК молекулярна маса коливається від 1 · 10 6 до 1,6 × 10 8, а у РНК - від 2 · 10 6 до 9,0 · 10 6.

Білки у віріонів виявлені в незначній кількості, вони складаються з 16-20 амінокислот. Крім капсидних білків, є ще внутрішні білки, пов'язані з нуклеїнової кислотою. Білки обумовлюють антигенні властивості вірусів, а також в силу щільного укладання поліпептидних ланцюгів захищають вірус від дії ферментів клітини господаря.

Ліпіди і вуглеводи виявлені у зовнішній оболонці складних віріонів. Джерелом ліпідів і вуглеводів є оболонка клітини господаря. Полісахариди, які входять до складу деяких вірусів, обумовлюють здатність їх викликати аглютинацію еритроцитів.

ферменти вірусів. Віруси не мають власного метаболізму, тому вони не потребують ферментах обміну речовин. Однак у деяких вірусів виявлено наявність ферментів, що сприяють проникненню їх в клітку господаря. Наприклад, у вірусу грипу А виявлено нейрамінідаза, відщеплюється нейрамінової кислоту, що міститься в оболонках тварин клітин (еритроцитів і ін.). У фагів - лізоцим, який руйнує клітинну оболонку, фосфатаза та ін.

Виявлення вірусних антигенів. Вірусні антигени в інфікованих клітинах господаря можна виявити за допомогою методу імунофлюоресценції. Препарати, що містять клітини, інфіковані вірусами, Обробляють специфічними імунними люминесцирующими сироватками. При перегляді в люмінесцентному мікроскопі в місцях скупчення вірусних частинок спостерігається характерне світіння. Вид вірусу визначають за відповідністю специфічної люминесцирующей сироватки, що викликала світіння.

Впровадження вірусу в клітину, взаємодія його з кліткою господаря і репродукція (Розмноження) складаються з ряду послідовних стадій.

Стадія 1. Починається з процесу адсорбції за рахунок рецепторів віріона і клітини. У складних віріонів рецептори розташовуються на поверхні оболонки в вигляді шиловидних виростів (вірус грипу), у простих віріонів - на поверхні капсида.

Стадія 2. Проникнення вірусу в клітину господаря протікає по-різному у різних вірусів. Наприклад, деякі фаги протикають оболонку своїм відростком і впорскують нуклеїнових кислот в клітку господаря (див. Розділ 8). Інші віруси потрапляють в клітину шляхом втягування вірусної частинки за допомогою вакуолі, т. Е. На місці впровадження в оболонці клітини утворюється поглиблення, потім краї її сходяться і вірус виявляється в клітці. Таке втягування називається віропексіса.

Стадія 3. "Роздягання вірусу" (дезінтеграція). Для свого відтворення вірусна нуклеїнова кислота звільняється від захищають її білкових покривів (оболонки і капсида). Процес роздягання може початися під час адсорбції, а може статися тоді, коли вірус знаходиться вже всередині клітини.

Стадія 4. На цій стадії відбувається реплікація (відтворення) нуклеїнових кислот і синтез вірусних білків. Ця стадія відбувається за участю ДНК або РНК клітини господаря.

Стадія 5. Складання вириона. Цей процес забезпечується самосборке білкових частинок навколо вірусної нуклеїнової кислоти. Синтез білка може початися безпосередньо після синтезу вірусної нуклеїнової кислоти або після інтервалу в кілька хвилин або кілька годин. У одних вірусів самосборка відбувається в цитоплазмі. У інших в ядрі клітини господаря. Освіта зовнішньої оболонки (пеплоса) завжди відбувається в цитоплазмі.

Стадія 6. Вихід віріона з клітки господаря відбувається шляхом просочування вірусу через оболонку клітини або через отвір, що утворився в клітці господаря (в цьому випадку клітина господаря гине).

Типи взаємодії вірусу і клітини. Перший тип - продуктивна інфекція - характеризується утворенням нових віріонів в клітці господаря.

Другий тип - абортивна інфекція полягає в тому, що обривається реплікація нуклеїнової кислоти.

Третій тип - характеризується встраиванием вірусної нуклеїнової кислоти в ДНК клітини господаря; виникає форма співіснування вірусу і клітини господаря (вірогенія). У цьому випадку забезпечується синхронність реплікації вірусної і клітинної ДНК. У фагів це називається лізогенія.

мікроскопічне дослідження. При окремих вірусних інфекціях в цитоплазмі або ядрах клітин організму господаря спостерігаються специфічні внутрішньоклітинні тільця - включення, що мають діагностичне значення (тільця Бабеша - Негрі при сказі, тільця Гварніері при віспі і ін.). Розміри вірусних частинок і тілець-включень вдається штучно збільшити спеціальними методами обробки препаратів з протравов і імпрегнацією (наприклад, метод сріблення по Морозову) і спостерігати за иммерсионной мікроскопії. Більш дрібні віріони, що лежать за межами видимості оптичного мікроскопа, виявляються тільки при електронній мікроскопії. Існують різні точки зору щодо внутрішньоклітинних включень. Одні автори вважають, що вони являють собою скупчення вірусів. Інші вважають, що вони виникають в результаті реакції клітини на впровадження вірусів.

генетика вірусів. Модифікація (неуспадковане зміни) у вірусів обумовлюється особливостями клітини господаря, в якій відбувається репродукція вірусу. Модифіковані віруси набувають здатність заражати клітини, аналогічні тим, в яких вони модифікувалися. У різних вірусів модифікація по-різному проявляється. Наприклад, у фагів змінюється форма "негативних плям" (фагових колоній).

Мутація - у вірусів виникає під впливом тих же мутагенів, які викликають мутацію у бактерій (фізичні і хімічні чинники). Виникає мутація під час реплікації нуклеїнових кислот. Мутації зачіпають різні властивості вірусів, наприклад чутливість до температури і ін.

Генетична рекомбінація у вірусів може виникнути в результаті одночасного зараження клітини господаря двома вірусами, при цьому може відбутися обмін окремими генами між двома вірусами і утворюються рекомбінанти, що містять гени двох батьків.

Генетична реактивация генів іноді відбувається при схрещуванні инактивированного вірусу з повноцінним, що призводить до порятунку инактивированного вірусу.

Спонтанна і спрямована генетика вірусів має велике значення в розвитку інфекційного процесу.

Стійкість до факторів навколишнього середовища. Більшість вірусів інактивується при дії високих температур. Проте є винятки, наприклад вірус гепатиту термостійкий.

До низьких температур віруси не чутливі, ультрафіолетові сонячні промені надають інактивує дію на віруси. Розсіяне сонячне світло діє на них менш активно. Віруси стійкі до гліцерину, що дає можливість тривалий час зберігати їх в гліцерині. Вони стійкі до антибіотиків (при культивуванні вірусів досліджуваний матеріал обробляють антибіотиками для придушення бактеріальної флори).

Кислоти, луги, дезінфікуючі речовини інактивують віруси. Однак деякі віруси, інактивовані формаліном, зберігають імуногенні властивості, що дозволяє використовувати формалін для отримання вакцин (вакцина проти сказу).

сприйнятливість тварин. Коло сприйнятливих тварин для деяких вірусів дуже широкий, наприклад до вірусів сказу чутливі багато тварин. Деякі віруси вражають тільки один вид тварини, наприклад вірус чуми собак вражає тільки собак. Є віруси, до яких тварини не чутливі - наприклад, вірус кору і т. Д.

Органотропність вірусів. Віруси мають здатність вражати певні органи, тканини і системи. Наприклад, вірус сказу вражає нервову систему. Вірус віспи має дермотропні і т. Д.

Виділення вірусів в навколишнє середовище. З хворого організму віруси можуть виділятися з калом, наприклад вірус поліомієліту та інші ентеровіруси. Вірус сказу виділяється зі слиною, вірус грипу - з виділенням слизової носоглотки і т. Д.

Основні шляхи передачі вірусів. Повітряно-краплинний (грип, віспа), харчової (поліомієліт, гепатит А), контактно-побутовий (сказ), трансмісивний (енцефаліт).

противірусний імунітет. Організм людини володіє природженою стійкістю до деяких вірусів. Наприклад, людина не чутливий до вірусу чуми собак. Тварини не чутливі до вірусу кору. У цих випадках противірусний імунітет заснований на відсутності клітин, здатних підтримувати репродукцію вірусів.

Противірусний імунітет обумовлюється як клітинними, так і гуморальними факторами захисту, неспецифічними і специфічними. Неспецифічні фактори. Потужним інгібітором репродукції вірусів є білкова речовина - інтерферон. В здоровому організмі він міститься в незначній кількості, а віруси сприяють продукції інтерферону і кількість його значно збільшується. Він неспецифичен, так як блокує репродукцію різних вірусів. Однак він володіє тканинної специфічністю, т. Е. Клітини різних тканин утворюють неоднаковий інтерферон. Вважають, що механізм дії його полягає в тому, що він перешкоджає синтезу білка в клітині господаря і цим припиняє репродукцію вірусу.

До специфічних факторів противірусного імунітету відносяться вируснейтрализующие антитіла, гемагглютинирующие і преципитирующие.

Методи культивування вірусів. Віруси розмножуються тільки в життєздатних клітинах. Їх культивують: в курячих ембріонах (рис. 53), культурах тканини людини і різних тварин, в організмі чутливих тварин, сприйнятливих членистоногих.

У перший період розвитку вірусології основним методом вивчення вірусів було штучне зараження тварин, але цей метод складний, і крім цього тварини до багатьох вірусів виявилися несприйнятливі.

Велике значення в розвитку вірусології мало запровадження методів культивування вірусів в курячих ембріонах і в культурі клітин тканин людини і тварин.

Зараження курячих ембріонів. Для репродукції вірусів використовують курячі ембріони 7-12-денного віку, інкубовані в термостаті при 37 ° С. Необхідною умовою для правильного розвитку зародка є дотримання певної вологості повітря, яку можна створити, помістивши в термостат посудину з водою.

Придатність курячого ембріона для зараження визначається за наявністю рухів ембріона і розвиненої мережі кровоносних судин на хоріон-аллантоісной оболонці при просвічуванні за допомогою овоскопа.

Культивування вірусів в курячих ембріонах проводиться в різних місцях ембріона, який заражають (див. Рис. 53):

1) на хоріон-аллантоісную оболонку,

2) в аллантоісную порожнину;

3) в амніотичну порожнину;

4) в жовтковий мішок.

Зараження курячих ембріонів проводять в боксі з використанням стерильних інструментів. Перед зараженням курячі ембріони дворазово протирають ватним тампоном, змоченим спиртом.

Зараження на хоріон-аллантоісную оболонку. Після дезінфекції яйця обережно зрізають шматочок шкаралупи з тупого кінця, знімають подскорлупную оболонку - при цьому виявляється хоріон-аллантоісная оболонка. Інфекційний матеріал в кількості 0,1-0,2 мл за допомогою шприца або пастерівської піпетки наносять на хоріон-аллантоісную оболонку. Після зараження отвір закривають ковпачком і просвіт між ним і курячим ембріоном заливають парафіном.

На іншій стороні яйця простим олівцем пишуть назву інфекційного матеріалу і дату зараження.

Зараження в амніотичну порожнину. Яйце овоскопіруют і на бічній стороні вибирають ділянку, де хоріон-аллантоіс позбавлений великих кровоносних судин. Ця ділянка відзначають олівцем. Яйця укладають на підставку в горизонтальному положенні, дезінфікують і спеціальним стерильним списом проколюють отвір в шкаралупі на глибину 213 мм, через яку вводять на цю ж відстань голку з інфекційним матеріалом безпосередньо в амніотичну порожнину. Для того щоб вводиться рідина не витікала назад, попередньо роблять прокол над повітряним мішком, після чого обидва отвори заливають парафіном.

Зараження в аллантоісную порожнину. Зараження проводять в затемненому боксі. Відзначають повітряний простір, шкаралупу над повітряним простором дезінфікують і через отвір в шкаралупі вводять у напрямку до ембріону голку шприца з матеріалом. Якщо голка потрапила в аллантоісную порожнину, то спостерігається зміщення тіні ембріона. Після зараження отвір заливають парафіном.

Зараження в жовтковий мішок. Шкаралупу дезінфікують. Яйце поміщають на підставку тупим кінцем вправо так, щоб жовтковий мішок був повернутий догори. Над повітряною камерою в центрі проколюють отвір. Через отвір в шкаралупі в горизонтальному напрямку на глибину 2-3 мм вводять голку шприца, яка потрапляє в жовтковий мішок. Матеріал вводять в обсязі 0,2-0,3 мл. Після введення матеріалу отвір парафінують.

Температурний режим і тривалість інкубації залежать від біологічних властивостей введеного вірусу.

Інфіковані яйця щодня перевіряють - овоскопіруют для перевірки життєздатності ембріона. Якщо ембріони гинуть в першу добу, то причиною цього зазвичай буває травма при зараженні. Такі яйця виводять з досвіду.

При необхідності окремо досліджувати кожну складову частину ембріона матеріал збирають у певному порядку: відсмоктують аллантоісную рідина, потім амніотичну рідину, розрізають хоріон-аллантоісную оболонку, відокремлюють амниотическую оболонку, ембріон, жовтковий мішок і тільки після цього витягують хоріон-аллантоісную оболонку, відокремивши її від внутрішньої поверхні шкаралупи. Наявність вірусу в зараженому ембріоні визначають по характерних змін хоріон-аллантоісной оболонки зараженого курячого ембріона.

Віруси, що не володіють гемагглютинирующей активністю, виявляють за допомогою РСК.

Для виявлення вірусу в аллантоісной або амниотических рідинах заражених ембріонів ставлять РДА (гемагглютинация викликається аллантоісной або амніотичної рідинами або суспензією, приготовленої з хоріон-аллантоісной оболонки).

Культивування вірусів в культурі клітин. Для накопичення вірусів в чувстсітельних клітинних культурах використовуються тканини людини і різних тварин. Найбільше практичне застосування отримали одношарові культури первинно-трипсінізірована і перещеплюваних ліній клітин.

Одношарові культури клітин вирощують в скляних плоских судинах-матрацах. Клітинна суспензія в рідкому поживному середовищі при температурі 37 ° С дозволяє отримати "in vitro" шар клітин з певною гістологічної структурою. Присутність вірусів в культурах тканин виявляють по зміні (дегенерації) клітин. Тип вірусів визначають шляхом нейтралізації дії вірусів при додаванні до віруссодержащего матеріалу відповідних типоспецифічних сироваток.

Ці методи дозволяють швидше враховувати результати дослідження і є більш економічними. У тих випадках, коли віруси не викликають цитопатичної дії (дегенерації) і не розвиваються в курячих ембріонах, користуються методами зараження тварин (див. Розділ 11).

Для культивування вірусів використовують перещеплюваних клітини, які частіше отримують з клітин злоякісних пухлин.

Одношарові культури отримують з ембріонів людини, курки, тварин.

Перевага одношарових культур клітин - простота методики і легкість обліку.

Здатність клітин до розмноження поза організмом пов'язана зі ступенем диференціації тканини. Менш диференційовані тканини мають більшу здатність до проліферації (сполучна, епітеліальна тканина).

Сутність методів при приготуванні первинних культур тканини полягає в руйнуванні міжклітинної тканини і роз'єднанні клітин для подальшого отримання моношару.

Роз'єднання клітин проводиться шляхом впливу на тканину протеолітичних ферментів, найчастіше трипсину. Розчин трипсину сприяє роз'єднанню клітин при збереженні у них здатності до розмноження. Для вирощування культури клітин необхідна живильне середовище. Склад середовища складний, він включає цілий ряд інгредієнтів: амінокислоти, глюкозу, вітаміни, мінеральні солі, коферменти і т. Д. Отримання культури тканини проводять в строго асептичних умовах. У середу додаються антибіотики (500 ОД пеніциліну і 250 ОД стрептоміцину в 1 мл) для пригнічення росту бактеріальної флори.

Підготовлену тканину заливають 0,25% розчином підігрітого трипсину і інкубують в термостаті при 37 ° С. Під час інкубації тканину періодично помішують шляхом обертання колби. Трипсінізірована клітини центрифугують при 800-1000 об / хв протягом 5 хв.

Тріпсінізаціі і центрифугування проводять дуже обережно, щоб не травмувати клітини. Після центрифугування надосадову рідину видаляють, а осад клітин поміщають в невеликий обсяг живильного середовища. Для отримання однорідної маси суспензія клітин фільтрують через один шар марлі в воронці (стерильною). Суспензія клітин перевіряють на стерильність шляхом посіву по 0,1 мл, в 2 пробірки з цукровим бульйоном.

Успіх культивування клітин залежить від посівної Дози, тому після тріпсінізаціі проводять підрахунок клітин в камері Горяєва. Після підрахунку суспензія клітин розводять живильним середовищем з такого розрахунку, щоб в 1 мл містилося 500000-1000000 клітин і розливають по пробірках і матраців. Пробірки з культурою тканини инкубируют в термостаті в похилому положенні.

Посіяні культури щодня переглядають під малим збільшенням мікроскопа для визначення характеру їх зростання. Нормальні проліферуючі клітини світлі і ростуть одношаровим пластом. Якщо клітини темні, зернисті і не проліферують, що може бути результатом забруднення (погана обробка посуду або забруднення інгредієнтів), то такі культури вилучають з досвіду.

Зміна живильного середовища через 2-3 дня після посіву покращує інтенсивність проліферації.

Нормальні, добре проліферуючі клітини заражають досліджуваним матеріалом.

Перещеплюваних культури переважно отримують з злоякісних пухлин. Штам Hela - культура клітин раку шийки матки жінки на ім'я Helena (отриманий в 1950 р); штам Нер-2 виділено від хворого на рак гортані. Зростання цих клітин підтримується в лабораторіях шляхом послідовних пасажів. Особливість їх полягає в тому, що вони розмножуються протягом тривалого терміну. В даний час ці клітини пройшли вже тисячі генерацій. В процесі пасажів вони втрачають деякі морфологічні і біохімічні властивості - піддаються мутації. Однак залишаються цілком придатними для культивування в них вірусів. Культурою цих клітин користуються лабораторії всього світу.

Розмноження вірусу в культурі клітин відбувається в різні терміни залежно від властивостей вірусу і виду клітин.

Про наявність вірусу судять по цитопатичної дії. У мікроскопі спостерігається дегенерація клітин. Час цитопатичної дії і його характер залежать від дози і властивостей вірусу.

У деяких вірусів цитопатическое дія виявляється через кілька днів (вірус віспи), у інших - через 1-2 тижні (вірус гепатиту та ін.).

В даний час відомі вже сотні вірусів, що вражають людину. Боротьба з вірусними інфекціями здійснюється різними методами. Найбільш ефективна імунізація. Таким способом ліквідована віспа, скорочена захворюваність на поліомієліт. Важливе значення в боротьбі з вірусними інфекціями мають громадська профілактика - знищення бродячих собак (боротьба зі сказом), особиста профілактика і т. Д.

Однак ці заходи не можуть забезпечити ліквідацію всіх вірусних захворювань. Вчені наполегливо шукають шляхи, за допомогою яких можна було б вразити вірус, не пошкодивши клітку, в якій він знаходиться.

Тому закономірно, що в програмі КПРС вірусологія названа однією з провідних галузей природничо-наукових знань, яка повинна отримати переважне розвиток в найближчі роки.

Основні методи дослідження вірусів. 1. Реакція гемаглютинації, реакція затримки гемаглютинації, реакція непрямої гемаглютинації. Реакція зв'язування комплементу.

2. Реакція нейтралізації вірусів в культурі тканин.

3. Метод імунофлюоресценції.

4. Гістологічний метод - виявлення включень (тілець Бабеша - Негрі - при сказі; тілець Пашена - при віспі і ін.).

5. Біологічний метод.